יצירת וריאנטים של הימלטות מנגיף השפעת מפני נוגדנים מנטרלים

הערה: נוגדנים ספציפיים ל-HA המעכבים שכפול נגיפי יכולים בדרך כלל להיות מסווגים ל-i) כאלה שנקשרים או סמוכים לאתר הקישור של הקולטן על גבי הראש הכדורי ו-ii) כאלה שנקשרים באופן דיסטלי של תחום קשירת הקולטן, הכולל את הצד הלטרלי של הראש הכדורי ואת אזור הגבעול של ה-HA. נוגדנים המכוונים לאתר קשירת הקולטן מונעים מעורבות של מוטיבים של חומצה סיאלית על פני השטח של תאי המטרה וניתן למדוד אותם באמצעות בדיקת עיכוב המגלוטיציה (HI). נוגדנים שליליים ל-HI, כגון נוגדנים ספציפיים לגבעול, עדיין יכולים לעכב שכפול נגיפי, אך ניתן להעריך אותם רק באמצעות מבחני נטרול.

1. סיווג נוגדנים על בסיס פעילויות HI

1. בדיקת HI
   1. בלוח תחתון V של 96 בארות, הוסף 25 μL של 1x PBS בעמודות 2 עד 12.
   2. לדלל את הנוגדן החד-שבטי (mAb) 7B2 (ספציפי לראש), 6F12 (ספציפי לגבעול) ובקרת איזוטיפ ל-100 מיקרוגרם/מ"ל ב-1x PBS ו-aliquot 50 μL של תכשירי הנוגדנים המדוללים לעמודה 1. כמו כן, כלול בקרה ללא mAb על-ידי הוספת 50 μL של 1x מלוחים חוצצי פוספט (PBS) (איור 1A).
   3. לבצע דילול סדרתי פי 2 של הנוגדנים על ידי העברת 25 μL מעמודה 1 לעמודה 2, וכן הלאה. מחק את 25 μL האחרונים מעמודה 12 (איור 1A).
      הערה: הקפד לכלול שורה ללא בקרת נוגדנים.
   4. לדלל את מלאי הנגיף (וירוס רה-אסורטנטי המבטא את המגלוטינין (HA) והנוירמינידז (NA) של A/קליפורניה/04/09 עם המקטעים הפנימיים של A/פורטו ריקו/8/34) ל-8 יחידות המגלוטינציה/מלאי וירוסים מדולל של 25 מיקרוליטר. הוסף 25 μL של מלאי וירוס מדולל (8 hemagglutination) לכל באר (שורות A עד G).
      הערה: תערובת הנוגדנים והווירוסים צריכה להיות בעלת נפח סופי של 50 μL עם ריכוז סופי התחלתי של 50 מיקרוגרם / מ"ל.
   5. דוגרים על הצלחת בטמפרטורת החדר (RT) למשך 45 דקות.
   6. עבור שורת הטיטרציה האחורית (H), הוסף 50 μL של 1x PBS על בארות H2 עד H12. הוסף 100 μL מתוך 8 יחידות hemagglutination / 25 μL לבאר H1. לדלל באופן סדרתי פי שניים על ידי העברת 50 μL מ-H1 ל-H2, וכן הלאה. יש להשליך את 50 μL האחרונים מבאר H12. לבסוף, הוסף 50 μL של 0.5% תאי דם אדומים עוף (RBC) לכל הבארות של צלחת V-bottom 96-well.
      הערה: דגימות mAb בבדיקה צריך להיות נפח סופי של 100 μL: mAb (25 μL), וירוס (25 μL) ו RBC (50 μL). הנפח הסופי של בקרת no mAb צריך להכיל 25 μL של 1x PBS, 25 μL של וירוס ו 50 μL של RBC.
   7. לדגור על הצלחת ב 4 ° C במשך 1 שעה.
   8. קרא חזותית את הצלחות לפעילות HI. אם יש קריאה חיובית עבור נוגדן מסוים, המשך לשלב 2.1 כדי ליצור וריאנטים לברוח. אם הנוגדן הוא HI-negative, המשך להלן לשלב 1.2 כדי להעריך אם לנוגדן יש פעילות מנטרלת בבדיקת תרבית תאים.
      הערה: קריאה חיובית של mAb פעיל HI מסומנת על-ידי כדורית RBC אדומה כהה במרכז באר (איור 1B; 7B2) שתיווצר טיפת דמעה כאשר לוח V בעל 96 בארות מוחזק בזווית של 45°. קריאה שלילית לא תיצור כדורית RBC אדומה כהה בבאר (איור 1B; 6F12 וללא mAb). בקרת האיזוטיפ גם לא תיצור כדורית RBC אדומה כהה, והיא אמורה להיראות זהה לנוגדן הספציפי לגבעול, 6F12 או לדגימת הבקרה ללא mAb (איור 1B).

2. דור של גרסאות מוטנטיות בריחה

הערה: נוגדנים מנטרלים שיש להם או חסרים פעילות HI מנותחים עוד יותר עם הפרוטוקולים הספציפיים המתוארים להלן.

1. פרוטוקול 1: נוגדנים חיוביים/חיוביים לנטרול HI (איור 2A)
   1. הכינו מלאי וירוסים של 10⁶ יחידות יוצרות פלאק / מיליליטר (PFU/mL) ב- 1x PBS בנפח 400 μL.
   2. הכינו ארבעה דילולים של הנוגדן המעניין בהגדלת ריכוזים (למשל, 0, 0.5, 0.05 ו-0.005 מ"ג/מ"ל) ב-1x PBS בנפח של 100 מיקרוליטר לדילול.
      הערה: וירוס מסוג פראי צריך תמיד לעבור במקביל ובהיעדר נוגדן. הרצפים של נגיפים אלה יסייעו להבחין בין הסתגלות לתנאי תרבית תאים לבין בריחה ממוטציות.
   3. מערבבים 100 μL של 10⁶ PFU/מ"ל של וירוס עם 100 μL של כל דילול נוגדנים או 100 μL של 1x PBS.
   4. דגירה במשך שעה אחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס (עם 5% CO₂). מערבולת בקצרה. יש להזריק 200 מיקרוליטר מכל תערובת לביצי תרנגולת עובריות ללא פתוגן ספציפי (SPF).
   5. לדגור על הביצים ב 37 ° C (ללא CO₂) במשך 40-44 שעות.
   6. להקריב את הביציות הנגועות בנגיף על ידי דגירה ב 4 ° C במשך מינימום של 6 שעות.
   7. לקצור את הנוזל האלנטואי מהביצים, כפי שתואר קודם לכן.
   8. בצע את בדיקת hemagglutination, כמתואר לעיל. אם לכל תכשירי הנוזל האלנטואי אין טיטרים hemagglutination, חזור משלב 2 עם דילול נוגדנים הנעים בין 0.005 מ"ג / מ"ל ל 0.00005 מ"ג / מ"ל < / > הערה: ריכוז רווי של נוגדן HI חיובי עשוי לנטרל את כל חלקיקי הנגיף הנוכחים. לכן, ייתכן שיהיה צורך להקטין את כמות הנוגדנים הנוכחים בעובר.
   9. אשר את גרסאות הבריחה על-ידי ביצוע בדיקת HI (שלב 1.1).
      הערה: נוגדנים HI-active חוסמים מעורבות HA של מוטיבים של חומצה סיאלית על תאי המטרה. לכן, וירוס בנוכחות נוגדן קוגניטיבי שלה מאבד את היכולת agglutinate RBCs (נוכחות של גלולת RBC). תיאורטית, גרסאות בריחה של נוגדנים פעילים HI עדיין יכולות לקשור מוטיבים של חומצה סיאלית אפילו בנוכחות הנוגדן הקוגנטי שלה ולכן יכולות לאגד RBCs (ללא גלולת RBC). אם HI של הנוגדן המעניין עדיין ניתן לזיהוי, חזור על הפרוטוקול משלב 2.1.2 עם ריכוז התחלתי גבוה יותר של הנוגדן.

איור 1: בדיקת HI. (A) סכימה להגדרת בדיקת HI לבדיקת הפעילות של שני mAbs 7B2 ספציפיים לעכבר מסוג H1 (ספציפי לראש) ו-6F12 (ספציפי לגבעול) באמצעות לוח תחתון V בעל 96 בארות, ו-(B) דוגמה לתוצאות של בדיקת HI

איור 2: יצירת מוטציות בריחה. המתודולוגיה המוצעת תהיה תלויה ב-HI ובפעילות המיקרו-נטרול שמציג הנוגדן. יצירת מוטציות בריחה כנגד (A) נטרול נוגדנים חיוביים ל-HI עשוי לדרוש מעבר יחיד בביציות, בעוד (B) נטרול נוגדנים HI-שליליים עשוי לכלול מעברים מרובים עם כמויות נוגדנים הולכות וגדלות בתרבית רקמת התא.