יצירת נוגדנים חד-שבטיים רקומביננטיים מתרביות תאים של יונקים

תקציר

מקור: Nogales-Gadea, G. et al., דור של נוגדנים חד-שבטיים מסוג IgG אנושי רקומביננטי מתאי B ממוינים אימורטליים.J. Vis. Exp.(2015)

סרטון זה מדגים שיטה ליצירת נוגדנים מתאי יונקים על ידי החדרת וקטורי פלסמיד עם גנים כבדים וקלים בשרשרת. וקטורים אלה מתקשרים עם פוליאתילנימין ונכנסים לתאים על ידי יצירת פוליפלקסים; מאוחר יותר, הם מתורגמים לחלבונים בודדים ומורכבים לנוגדנים מלאים, המופרשים למדיום החוץ תאי.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. בידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs)

1. צנטריפוגה 25 מ"ל של הדם heparinized של המשתתפים ב 900 x גרם במשך 15 דקות, בהקדם האפשרי לאחר מיצוי הדם. אם יש פחות דם, צמצמו את הריאגנטים בהתאם. בצע את כל השלבים הבאים במכסה מנוע.
2. מעבירים את הסרום לצינורית נקייה. ניתן להשתמש בו בשלבים מאוחרים יותר להקפאת PBMCs או במקרה של חולים אוטואימוניים, לבדיקת נוגדנים עצמיים.
3. לדלל את הדם עם 10 מ"ל של Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 מדיה להשעות מחדש את התאים על ידי pipetting למעלה ולמטה.
4. הוסף 15 מ"ל של תמיסה המכילה רב-סוכרוז ונתרן דיאטריזואט (1.077 גרם/מ"ל) לשפופרת חדשה של 50 מ"ל.
5. הניחו בעדינות את הדם על גבי התמיסה בשלב 1.4 על ידי קירוב שני פתחי הצינורות זה לזה עד ששני הנוזלים באים במגע איטי מאוד, ולאחר מכן נטרלו את תרחיף PBMC באיטיות על גבי צינור 50 מ"ל. צעד זה הוא קריטי כדי שתהיה הפרדה טובה בין PBMCs.
6. צנטריפוגה הצינור המתקבל בשלב 1.5 ב 400 x גרם ללא בלימה בטמפרטורת החדר (RT) במשך 20 דקות.
7. לאחר הצנטריפוגה, לשחזר עם הצינור את הטבעת הלבנה המופיעה בחלק האמצעי של הצינור, אשר מכיל PBMCs.
8. לשטוף את התאים עם 25 מ"ל של RPMI 1640 מדיה.
9. צנטריפוגה 300 x גרם ב- RT למשך 10 דקות.
10. להשליך את supernatant ולשטוף את התאים עם 10 מ"ל של RPMI 1640. שוב צנטריפוגה כמו בשלב 1.9.
11. ספרו את ה-PBMCs עם תא נויבאואר כפי שדווח בעבר.
12. עבד את PBMCs כמו בסעיף 2 או לאחסן אותם לשימוש מאוחר יותר כדלקמן: 10 מיליון PBMCs להקפאה לכל צינור Cryovial מדולל ב 1 מ"ל של 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) ו 90% סרום המתקבל בשלב 1.2. מקפיאים בהדרגה ולאחסון ארוך בחנקן נוזלי.

2. צביעת PBMCs למיון CD22+ ואימונוגלובולין G (IgG+) לפי ציטומטריה של תאים

1. צלחת PBMCs בבקבוק 2 תרבית תאים 25 ס"מ עם 6 מ"ל של RPMI מלא 1640 בינוני (בתוספת L-גלוטמין, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES) חוצץ, 50 U / ml פניצילין, 50 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין ו 10% של סרום בקר העובר) ולתת להם לשחזר O/N באינקובטור ב 37 ° C ב 5% פחמן דו חמצני (CO₂).
2. חסום צינורות סטריליים של מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) עם תמיסת מלח חוצצת סטרילית של 4% אלבומין פוספט (PBS) למשך הלילה (O/N). שטפו את הצינורות פעמיים עם PBS ומלאו אותם עם 500 μl של מדיום RPMI 1640 מלא. השתמש בצינורות אלה לשחזור התאים לאחר המיון.
3. אסוף את מרכזיות המרכזיות, בצינור ובצנטריפוגה במהירות של 400 x גרם ב-RT למשך 5 דקות.
4. השהה מחדש את התאים במאגר תוויות (ראה שלבים 2.5 ו- 2.6) וספור אותם. חיץ הסימון הוא סרום בקר עוברי סטרילי 2% וחומצה אתילאנדיאמין טטראצטית (EDTA) 1 mM ב- PBS.
5. הכינו 3 צינורות FACS עם 10⁵ תאים כל אחד והשהו אותם מחדש ב-100 מיקרוליטר של מאגר תיוג. צינורות אלה ישמשו להגדרת שערי המיון.
   1. בצינור הראשון הוסף 5 μl של נוגדן Anti CD22 PerCP (מומלץ בגיליון הנתונים של היצרן), בצינור השני 20 μl של anti IgG PE (מומלץ בגיליון הנתונים של היצרן), ושום דבר בצינור השלישי. דוגרים על קרח ובחושך במשך 30 דקות.
6. להשהות מחדש 5 מיליון תאים ב 200 μl של חיץ תיוג בצינור FACS ולהוסיף 10 μl של anti CD22 PerCP ו 40 μl של anti IgG PE. לדגור על התאים על קרח וחושך במשך 30 דקות. אם המיון של מספר גבוה יותר של תאים רצוי, קנה מידה את כל הריאגנטים.
7. תאי צנטריפוגה ב 400 x g עם בלם נמוך במשך 5 דקות ב RT.
8. דקנט ברכות את הסופר-נאנט.
9. השהה מחדש את התאים ב- 500 μl של מאגר התוויה. תאי צנטריפוגה ב 400 x g עם בלימה נמוכה במשך 5 דקות ב- RT. חזור על שלבים 2.7 ו- 2.8
10. דקנט ברכות את supernatant ו resuspend את התאים ב 300 μl של סל"ד מדיה מלאה.
11. העבירו את התאים דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר. התאים מוכנים למיון.

3. מיון תאי B CD22+ ו- IgG+

1. השתמש 3 צינורות בקרה כדי לקבוע את הכדאיות של התאים. בבקרה ללא צביעה, השתמש בתרשים הפיזור קדימה וגודל כדי להגדיר את גידור הלימפוציטים. הפקדים עם CD22 PerCP ו- Anti-IgG PE משמשים להקמת השערים, ושער המיון. בצע את הפעולות הבאות שדווחו בעבר.
   הערה: שער הוא קבוצה של גבולות ערך המשמשים לבידוד קבוצה מסוימת של אירועים ציטומטריים, במקרה שלנו תאים, מקבוצה גדולה. במקרה של שער מיון גבולות הערך מאפשרים שחזור של האירועים הציטומטריים, תאים, הנמצאים בתוך הגבולות שהוגדרו: CD22+ ו- IgG+.
2. כצינור איסוף במיון, השתמש בצינורות חסומים עם 500 μl של מדיום RPMI 1640 מלא, המתקבל משלב 2.2.
3. המשך למיין חיובי כפול: CD22+ IgG+. שים לב למספר התאים הסופי בכל תנאי. צלחת ממוינת תאים על גבי תאים מזינים בהקדם האפשרי.

4. הקרנה של תאי הזנה

NOTE: בצע את הכנת תאי ההזנה בין 1 - 3 ימים לפני המיון. לפחות 5,000 תאי wi38 נדרשים לכל באר בצלחת באר עגולה 96. בצע את שלבים 4.1, 4.2 ו- 4.4 במכסה מנוע.

1. טפח את תאי wi38 ב 37 ° C ו 5% CO₂ ב RPMI מלא 1640 בינוני (כמו עבור PBMCs) עד למספר הרצוי של תאים הגיעו.
2. הקרינו אותם ב-50 אפורים, בהתאם לפרוטוקול שתואר קודם. בצע הקרנה לאחר שתאי wi38 עברו טריפסיניזציה והשעיה מחדש בתווך סל"ד מלא, או עם wi38 מחובר לבקבוק התרבית וטריפסינזציה לאחר ההקרנה. בצע את השיטה עבור טריפסיניזציה שצוין על ידי הספק של תאי wi38. להקרין את מספר התאים הדרושים לכיסוי הבארות הדרושות לציפוי תאי IgG+ B (1% מכלל PBMC שנספר בשלב 1.11).
3. צלחת 90 μl המכילה 5,000 תאי wi38 מוקרנים בכל באר מתוך 96 צלחת הבאר העגולה. השאירו את הבארות בשורה החיצונית של הצלחת ריקות (כי הן מתאדות מהר יותר), והשתמשו רק ב-60 הבארות שבמרכז הצלחת לציפוי תאים. מלא את הבארות החיצוניות כי הם מסגור את הצלחת עם 200 μl של PBS.
4. הניחו אותם באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ב-5% CO₂, עד לצורך.

5. ציפוי PBMCs ממוינים, וירוס אפשטיין-בר (EBV) זיהום וגידול

1. לדלל את PBMCs ממוינים, כדי צלחת 50 תאים ב 50 μl של RPMI 1640 בינוני שלם לכל באר בלוח 96 באר עגול (בעבר מצופה עם wi38 תאים מוקרנים). בצע שלבים במכסה מנוע המצויד לעבודת EBV.
   הערה: זיהום של 50 תאים לכל באר הוא אופטימלי ומגדיל את הסבירות לייצר נוגדן חד שבטי, עם זאת, מומלץ לאמת זאת על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR) כפי שתואר קודם.
2. הוסף 60 μl של סופרנאטנט EBV (המכיל 3 - 4 x 10,⁸ עותקים נגיפיים / מ"ל) לכל באר בצלחת 96 הבאר העגולה. יש לנקוט משנה זהירות במהלך עבודת EBV.
3. יש להוסיף 1 מק"ג/מ"ל CpG (ODN2006) לכל באר.
4. השאר את התאים באינקובטור ב 37 ° C ב 5% CO₂.
5. צג חזותי שיבוט גדל מתחת למיקרוסקופ לאחר שבוע.
   הערה: כמה דוגמאות לצמיחת תאי B ניתן לראות להלן בסעיף התוצאות. שימו לב שקצב הגדילה של השיבוטים עשוי להשתנות, וייתכן שיהיה צורך בזמן נוסף כדי להתחיל לראות מסת תאים מסוימת גדלה באמצע הבאר.
6. לאחר 1^רחוב שבועיים לפקח שיבוט גדל תחת מיקרוסקופ האור ולהמשיך חילופי התקשורת הראשון. לאט לאט pipet 90 μl של בינוני מן החלק העליון של הבאר ולאסוף צלחת נקייה 96 באר. (תאי B שוכבים בתחתית הבאר, ולכן אין סיכון לשאוף אותם).
   1. הוסף לכל באר 100 μl של מדיה RPMI 1640 מלאה בתוספת 1 מיקרוגרם / מ"ל של CpG (ODN2006) ו 50 U / ml של IL2. אם השיבוטים גדלים, נתח את חילופי המדיה הראשונים על ידי בדיקת אימונו סורבנט מקושרת אנזימים (ELISA) כמו בשלב 6.
7. עקוב אחר שיבוט גדל ושנה מדיה לאחר השבוע השלישי^{והרביעי} של גידול שוב על ידי לקיחת 90 μl של מדיה והוספת 100 μl של מדיה RPMI 1640 מלאה בתוספת 1 מיקרוגרם / מ"ל של CpG (ODN2006) ו 50 U / ml של IL2. השתמש supernatant שנאסף כדי לפקח על ייצור IgG על ידי ELISA כמו בשלב 6.
   הערה: לאחר חודש גידול השיבוט צריך להיות ניכר על ידי התבוננות בצברים של תאים עגולים שבדרך כלל שוכבים באמצע החלק התחתון העגול היטב.
8. בשלב זה, שנה מדיה באותו אופן כמו בשבועות הקודמים אבל רק עם מלא RPMI 1640 מדיה. אינדיקטור טוב לדעת את הרגע הנכון לשנות את המדיה הוא צבע התקשורת, אם הוא הופך תאים צהבהבים צריך חילופי מדיה.
9. כאשר צלחות של 96 בארות מכילות שיבוטים גדולים (בערך 5 x 10⁵ תאים), העבירו אותם לבאר שטוחה של צלחת בת 24 בארות. הוסף 300 μl של מדיה RPMI 1640 מלאה לבאר החדשה. להשהות מחדש את השיבוט הגדל של 96 בארות, על ידי פיפטציה למעלה ולמטה מספר פעמים, ולהעביר תאים לבאר החדשה, תוך הפצה הומוגנית. הוסף מדיה חדשה בעת הצורך.
   1. כאשר בארות של צלחת 24 בארות מלאות תאים (כ 5 x 10⁶ תאים), להעביר לבאר שטוחה של צלחת 6 בארות. הוסף 2 מ"ל של מדיה RPMI 1640 מלאה לבאר החדשה. להשהות מחדש את התאים בצלחת 24 בארות על ידי pipeting למעלה ולמטה מספר פעמים, ולהפיץ אותם הומוגנית בבאר החדשה.
10. הוסף מדיה בעת הצורך. אם אין צורך לשמור על תאים בתרבית, גלול את התאים ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב RT. לאחסן את supernatants לבדיקת ELISA. לשטוף את גלולת התאים פעם אחת עם 1 x PBS, צנטריפוגה שוב ב 400 x גרם במשך 5 דקות, ולאחסן יבש ב -80 ° C עד מיצוי RNA.
    1. כאשר התאים בצלחת 6 בארות הופכים לנפגשים (בערך 20 x 10⁶ תאים), עוברים לצלחת תרבית 60 מ"מ. הוסף 4 מ"ל של מדיה RPMI 1640 מלאה לצלחת החדשה. להשעות מחדש את התאים בצלחת 6-well ולהעביר אותם כפי שנעשה הוא שלבים 5.9 ו 5.10.
11. הוסף מדיה חדשה בעת הצורך. בשלב זה, יש להקפיא תאים בכמות של 10-30 מיליון/מ"ל ב-90% נסיוב עגל עוברי וב-10% DMSO. אם רוצים כמויות גדולות יותר של תאים, המשך להרחיב את השיבוטים בלוחות שטח גדולים יותר.

6. ELISA לזיהוי נוגדנים מסוג IgG

1. יש להוציא 50 μl/well בצלחת ELISA של נוגדן F(ab)₂ אנטי-אנושי Fc מדולל 1,200 במאגר ציפוי. מאגר הציפוי מכיל 50 mM נתרן פחמתי (Na₂CO₃) pH 9.6.
2. אטמו את הצלחות במדבקת פלסטיק ודגרו שעה אחת ב-37°C. לחלופין, דגרו ב-4°C O/N.
3. שטפו כל באר 6 פעמים עם 200 מיקרוליטר של חיץ כביסה. מאגר כביסה מכיל 0.05% Tween-20 ב-1 x PBS. אין לגעת או לגרד את משטח הבאר במקום שבו הנוגדן נקשר.
4. חסום עם חיץ חוסם, 100 μl/well. חיץ חוסם מכיל 4% חלב יבש ללא שומן ב- PBS. אוטמים את הצלחת ודגרים שעה אחת ב-37°C.
5. אין לשטוף. השליכו את החיץ החוסם והדביקו את הצלחת 3 פעמים הפוכה על מגבת נייר כדי להסיר שאריות נוזלים.
6. לדגור על סופרנאטנטים וסטנדרטים של שיבוטים.
   1. עבור בדיקה ראשונה, דיללו סופרנאטנטים משובטים שהתקבלו בשלב 5.6 או 5.7 1/3 בסל"ד. עבור התקנים לדלל עם RPMI תמיסת IgG אנושית בינונית לקבל: 1,000 נ"ג/מ"ל, 500 נ"ג/מ"ל, 250 נ"ג/מ"ל, 125 נ"ג/מ"ל, 62.5 נ"ג/מ"ל, 31.25 נ"ג/מ"ל, 15.6 נ"ג/מ"ל וריק. יש להשתמש ב-50 מיקרוליטר/באר ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 60 דקות. נתח דילולים נוספים של הסופרנאטנט המשובט כדי לבדוק את זיקת הנוגדנים, כגון 1/10 או 1/100.
7. יש לכבס כפי שנעשה בשלב 6.3.
8. השתמש 50 μl/well של עז F (ab)2 אנטי אנושי IgG Fc peroxidase מצומד מדולל 1:20,000 במאגר הדגירה. מאגר הדגירה מכיל 1% אלבומין בסרום בקר (BSA) ו-0.02% טווין 20 ב-1x PBS. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 60 דקות.
9. יש לכבס כפי שנעשה בשלב 6.3.
10. הוסף תמיסת מצע 100 μl/well המכילה 0.1% 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB). דוגרים 10 דקות עד שנוצר צבע כחול יציב בבארות. תיזהר; אל תחכו יותר מדי זמן!
11. עצור את התגובה על ידי הוספת 50 μl של 2 M חומצה גופרתית (H₂SO₄). למדוד את הספיגה ב 450 ננומטר, בתוך 30 דקות לאחר הפסקת התגובה.
    הערה: כל הסופרנאטנטים של המשובטים עם 3 סטיות תקן מעל החסר ייחשבו חיוביים לנוגדנים אנושיים מסוג IgG. לאישור השיבוטים החיוביים יש לחזור על ELISA זו לפחות שלוש פעמים בסופרנאטנטים שונים של אותו שיבוט. כמו כן, כדי לשלול את האפשרות של תגובתיות צולבת לא ספציפית מומלץ להבטיח כי אין אות כאשר supernatants מודגרים בארות לא מצופה אבל חסום. בשלב זה, ניתן לבצע בדיקת זיהוי לסינון הספציפיות האנטיגנית של הנוגדנים המעניינים לפני המשך לסעיף 7.

7. בידוד RNA ו- DNA משלים של גדיל ראשון (cDNA) סינתזה של שיבוטים IgG מייצרים

1. ברגע הייצור של IgG מאושר על ידי ELISA, לחלץ את RNA של השיבוט.
2. לחילוץ רנ"א מתאים הגדלים בשלבים 5.7 או 5.9, השתמש בערכת סינתזת cDNA ישירה של תאי III, המאפשרת קבלת DNA מ-10,000 תאים לתא אחד.
3. לחילוץ RNA מכמויות גדולות יותר של תאים, או מהגלולה המאוחסנת בשלב 5.11, השתמש בערכת בידוד RNA טהורה גבוהה. מערכות אחרות של מיצוי RNA יכולות להתאים גם בשלב זה. בצע את הוראות היצרן.
4. עבור מספרי תאים בין 1 x 10⁶ ו- 1 x 10⁴ השתמש במערכת התמלול ההפוך, בהתאם להוראות היצרן. ניתן להשתמש גם במערכות אחרות לסינתזה cDNA של גדיל ראשון.

8. 1^st ו-2^nd PCR להגברת השרשראות הכבדות והקלות של שיבוטים של תאי B המייצרים IgG

1. עם cDNA של שיבוטים התא, המתקבל בשלב 5.6 ו 5.7 חיובי IgG ELISA בשלב 6, לבצע PCR עם פריימרים המפורטים בטבלה 1.
2. הגדר PCR עצמאיים עבור כל שרשרת IgG כבדה, קאפה ולמבדה. צור פתרון מלאי עם פריימרים קדימה ואחורה בריכוזים שווים. הוסף אותם לתגובה בריכוז הסופי של 0.4 מיקרומטר.
3. השתמש 1 μl של סינתזת cDNA כדי לבצע 1^ST PCR. כאן, בצע תגובות של 20 μl באמצעות הוראות היצרן של Takara Taq. לחלופין, השתמש פולימרזות אחרות.
4. מקם את ה-PCR^הראשון בתנאי המחזור הבאים: 94°C למשך 5 דקות; (50 מחזורים של: 94°C למשך 30 שניות; 58°C למשך 30 שניות, ו-72°C למשך 45 שניות; 72°C למשך 7 דקות; תנו לו להתקרר ב-4°C.כלול ריק בתגובה, כדי לזהות זיהומים אפשריים.
5. הכינו 1x TBE (89 mM Tris-borate ו-2 mM EDTA). בנפח של 100 מ"ל של 1x TBE להוסיף 1 גרם של agarose (1% ג'ל agarose). מחממים את התמיסה במיקרוגל כדקה, עד שהאגרוז מתמוסס. לאחר מכן להוסיף 4 μl של 10 מ"ג / מ"ל אתידיום ברומיד (או צבע DNA שווה ערך) ולערבב.
   1. יוצקים את התוכן למגש וממתינים עד שהוא מתפלמר. הפעל 5 μl של תערובת PCR בג'ל כדי לדמיין את הפסים. שברי שרשרת כבדים צריכים להיות סביב 400 - 550 bp, בעוד שרשרת קלה צריכה להיות סביב 300 - 400 bp. אם הפסים אינם מזוהים, המשך גם ל- 2^nd PCR.
6. השתמש 1 μl של תערובת PCR הראשון כדי לבצע PCR². השתמש באותם ריאגנטים שבשלב 8.2 אך השתמש בתמהיל המתאים של פריימרים (ראה טבלה 1). עבור ה-PCR^השני השתמש בתנאים הבאים: 94 °C למשך 5 דקות; (50 מחזורים של: 94°C למשך 30 שניות; 56.5°C למשך 30 שניות ו-72°C למשך 55 שניות); 72°C למשך 7 דקות; תן לו להתקרר ב 4 ° C. כלול ריק בתגובה, כדי לזהות זיהומים PCR אפשריים.
7. הכינו ג'ל אגרוז כמתואר ב-8.5. הפעל את הג'ל כדי לדמיין את מוצר ה- PCR כמו ב- 8.5.1 השתמש בהגברות המכילות את המקטעים בגודל הנכון לשיבוט בשלב 9 והפק את הנוגדנים בשלב 10.
8. רצף את ה- DNA, באמצעות תגובה של 10 μl המכילה: 100 ng של ה- PCR^השני השני, 0.2 מיקרומטר של תערובת הפריימר או הפריימר, 1 μl של הטרמינטור ו- 1 μl של החיץ. בצע את תגובת הרצף בתנאים הבאים: (25 מחזורים של: 96 ° C במשך 10 שניות; 50 ° C במשך 5 שניות; ו 60 ° C במשך 4 דקות); 60 °C למשך 7 דקות; תן לו להתקרר ב 4 ° C.
9. לטהר את תגובות הרצף עם עמודות microspin G50 בהתאם להוראות היצרן. הערך את רצפי הקשירה במנתח רצפים אוטומטי כמתואר לעיל. אלקטרופרוגרמות צריכות להיות נקיות ולהתאים לרצף אימונוגלובולינים יחיד.
   הערה: אם מוצרי PCR מראים רצפי אימונוגלובולינים לא ברורים או מעורבים, אנא שקול לשכפל אותם באמצעות מערכת TopoTA, כדי לקבל רצפים מבודדים ולאחר מכן המשך לשלב 9.

9. שיבוט וריצוף השרשראות הכבדות והקלות של שיבוטי IgG המייצרים

1. הכינו 1 מיקרוגרם DNA של וקטורים pFUSE2ss-CLIg-hk, pFUSE2ss-CLIg-hl2 ו-pFUSEss-CHIg-hG1.
2. לעכל וקטורים אלה עם אנזימי הגבלה מתאימים. השתמש ב- EcoRI וב- BsiWI עבור pFUSE2ss-CLIg-hk, EcoRI ו- AvrII עבור pFUSE2ss-CLIg-hl2, וב- EcoRI ו- NheI עבור pFUSEss-CHIg-hG1. השתמש 3 יחידות של כל אנזים הגבלה עבור 1 מיקרוגרם של DNA של וקטור.
   1. יש לעכל עם אנזים אחד ולטהר את המוצר המעוכל עם ערכת טיהור PCR. יש לעכל עם האנזים השני ולטהר עם ערכת מיצוי ג'ל (בהתאם לפרוטוקול היצרן). חותכים את שבר העניין מג'ל האגרוז. הכינו ג'ל אגרוז כמו בשלב 8.5.
3. עכל את מוצרי ה- PCR^השני של שיבוט IgG הייצור: EcoRI ו- BsiWI להגברת שרשרת קאפה, EcoRI ו- AvrII להגברת שרשרת למדא, ו- EcoRI ו- NheI להגברת שרשרת כבדה. יש לעכל עם אנזים אחד ולטהר את המוצר המעוכל עם ערכת טיהור PCR. לעכל עם האנזים השני ולטהר את המוצר המעוכל עם ערכת טיהור PCR. השתמש באותן יחידות של אנזימים וכמות DNA כמו בשלב 9.2.
4. קשר את מקטעי ה- PCR בתוך הווקטורים עם T4 DNA ligase 16 °C O/N בהתאם להמלצות היצרן. היחס המשמש צריך להיות 1: 2 (וקטור : להוסיף).
5. השתמש 1 μl של הקשירה כדי להפוך חיידקים DH5α. עקוב אחר תנאי היצרן של DH5α לצורך טרנספורמציה. להפיץ חיידקים בלוחות blasticidin או zeocin, בהתאם לסוג של וקטור בשימוש. לדגור את הצלחות O/N ב 37 ° C.
6. לגדל מושבות בודדות, ולמצות DNA עם ערכת miniprep, בהתאם להוראות היצרן. שימוש לגידול מושבה בודדת ומיצוי DNA של היצרן, המלצות מתוך ערכת המיני-הכנה של DNA. לנתח אותם על ידי עיכול עם אנזימים המשמשים להכנת וקטורים ותוספות כמו בשלבים 9.2 ו 9.3.
7. רצף את הדנ"א באמצעות 100 ננוגרם של הווקטור כפי שנעשה בשלבים 8.8 ו-8.9.

10. ייצור נוגדנים בתאי HEK

1. לגדל תאי HEK במדיום הנשר המעובד (DMEM) של דולבקו בתוספת 10% נסיוב עגל עוברי, 1% L-גלוקוז, 1% פניצילין/סטרפטאבידין (DMEM+) למפגש של 75% בלוח תרבית תאים בקוטר 150 מ"מ. בצע בשלב מכסה המנוע 10.1 עד 10.7.
2. לפני הטרנספקציה, להחליף את המדיום לבינוני כמו קודם אבל ללא נסיוב עגל עובר.
3. עבור כל טרנספקציה כבדה וקלה בשרשרת, הכינו תערובת טרנספקציה עם 2.5 מ"ל של DMEM (ללא סרום), 9 מיקרוגרם של הווקטור עם השרשרת הכבדה, 6 מיקרוגרם של הווקטור עם השרשרת הקלה, ו-100 מיקרוליטר של תמיסת פוליאתילנימין (PEI) (ממלאי של 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר). יש לדגור ב-RT למשך 15 דקות.
4. מוסיפים בעדינות 2.5 מ"ל מתערובת הטרנספקציה שהוכנה בשלב 10.3 לתאי HEK בצלחת. רוק את הצלחת כדי להפיץ הומוגנית.
5. לדגור על התאים באינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO₂ במשך 24 שעות.
6. החליפו את התרבית מדיום לבינוני ללא נסיוב עגל עובר.
7. לאסוף את המדיום מן הצלחות 4 ימים מאוחר יותר.
   הערה: ניתן להשתמש בנוגדנים בתקשורת כדי לאפיין את תגובתם במבחנה וב- in vivo.

טבלה 1. פריימרים בשימוש.

1st PCR פריימרים
	פורוורד (5'-3')	הפוך (3'-5')
IgG	5′ L-VH 1 ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG	3′ Cγ CH1 GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC
	5′ L-VH 3 AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG
	5′ L-VH 4/6 CCCAGATGGGTCCTCCCAGGTGCAG
	5′ L-VH 5 CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG
κ	5′ L Vκ 1/2 ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG	3′ Cκ 543 GTTTCTCGTAGTCTGCTGCTCA
	5′ L Vκ 3 CTCTTCCTCCTCTCTCTCTCTCCCAG	3′ Cκ 494 GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT
	5′ L Vκ 4 ATTTCTCTGTGCTCTGGATCTCTCTCTG
	5′ פאן Vκ ATGACCCAGWCTCCABYCWCCCTG
λ	5′ L Vλ 1 GGTCCTGGGCCCAGTCTGCTG	3′ Cλ CACCAGTGTGGCCTTGTTGGCTTG
	5′ L Vλ 2 GGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTG
	5′ L Vλ 3 GCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG
	5′ L Vλ 4/5 GGTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTG
	5′ L Vλ 6 GTTCTTGGGCCAATTTTATGCTG
	5′ L Vλ 7 GGTCCAATTCYCAGGCTGTGGTG
	5′ L Vλ 8 GAGTGGATTCTCAGACTGGTGGTG
2 פריימריםPCR nd
	פורוורד (5'-3')	הפוך (3'-5')
IgH	5′ EcoRI VH1 CAACCGGAATTCGCAGGTGCAGCTGG TGCAG	3′ NheI JH 1,2,4,5 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGT גקאג
	5′ EcoRI VH1 עד 5 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG GTGCAG	3′ NheI JH 3 CTGCTAGCTAGCTGAGAGAGACGGTGA CCATTG
	5′ EcoRI VH3 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG GTGGAG	3′ NheI JH 6 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGTG ACCGTG
	5′ EcoRI VH3 23 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCT GTTGGAG
	5′ EcoRI VH4 CAACCGGAATTCAGGTGCAGCT GCAGGAG
	5′ EcoRI VH 4 34 CAACCGGAATTCAGGTGCAGCTAC AGCAGTG
	5′ EcoRI VH 1 18 CTTCCGGAATTCAGGTTCAGCT GGTGCAG
	5′ EcoRI VH 1 24 CTTCCGGAATTCACAGGTCCAGCT GGTACAG
	5′ EcoRI VH3 33 CTTCCGGAATTCACAGGTGCAGCT GGTGGAG
	5′ EcoRIVH 3 9 GATCCGGAATTCAGAAGTGCAGCT GGTGGAG
	5′ EcoRI VH4 39 GATCCGGAATTCACAGCTGCAGCT GCAGGAG
	5′ EcoRI VH 6 1 GATCCGGAATTCAGGTACAGCT GCAGCAG
κ	5′ EcoRI Vκ 1 5 CAACCGGAATTCAGACATCCAGATGA CCCAGTC	3′ BsiWI Jκ 1 עד 4 GCCACCGTACGTTTTTTTTTCCACCTTGGTC
	5′ EcoR1 Vκ 1 9 CTTCCGGAATTCAGACATCCAGTTGAC CCAGTCT	3′ BsiWI Jκ 2 GCCACCGTACGTTTCTCTCCAG CTTGGTC
	5′ EcoR1 Vκ 1D 43 CTTGGCGAATTCAGCCATCCGGATGA CCCAGTC	3′ BsiWI Jκ 3 GCCACCGTACGTTTGATATCCACT TTGGTC
	5′ EcoR1 Vκ 2 24 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATGA CCCAGAC
	5′ EcoR1 Vκ 2 28 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATG ACTCAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 2 30 CTTCCGGAATTCAGATGTGTGTGATGA CTCAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 3 11 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTG ACACAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 3 15 CTTCCGGAATTCAGAAATAGTGATG ACGCAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 3 20 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTGA CGCAGTCT
	5′ EcoR1 Vκ 4 1 CTTCCGGAATTCAGACATCGTGATG ACCCAGTC
λ	5′ EcoR1 Vλ 1 CTTCCGGAATTCACAGTCTGTGCT GACKCAG	3′ AvrII Jλ 1 עד 3 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTSACCT TGGTCCC
	5′ EcoR1 Vλ 2 CTTCCGGAATTCACAGTCTGCCC TGACTCAG	3′ AvrII Jλ 4 CTGGTTACCTAGGAAAATGATCAGC TGGGTTCC
	5′ EcoR1 Vλ 3 CTTCCGGAATTCATCCTATGAGC TGACWCAG	3′ AvrII Jλ 5 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGC TCGGTCCC
	5′ EcoR1 Vλ 4 עד 5 CTTCCGGAATTCACAGCYTGTG CTGACTCA	3′ AvrII Jλ 6 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGCT GGGTGCC
	5′ EcoR1 Vλ 6 CTTCCGGAATTCAAATTTTATGC TGACTCAG	3′ AvrII Jλ 7 CTGGTTACCTAGGAGGGGTCAC TTGGTCCAT
	5′ EcoR1 Vλ 7 עד 8 CTTCCGGAATTCACAGRCTGTG GTGACYCAG

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
היסטופק-1077	סיגמא-אולדריץ'	10771	תמיסה המכילה פוליסוקרוז ונתרן דיאטריזואט
סדרן תאים FACSAria II	BD Biosciences
96 צלחות מיקרו באר U-bottom	כוכב משנה	3799
מכון הזיכרון רוזוול פארק מתקדם (RPMI) 1640 בינוני	גיבקו, לייף טכנולוגיות	12633-020
סופרנאטנט 30% v/v EBV המכיל את קו התאים B95-8	ATCC	CRL-1612	3.4 x 108 עותקים/מ"ל
CpG2006	אינוויווגן	ODN 7909
תאי Wi38	סיגמא-אולדריץ'	90020107
אינטרלוקין-2	רוש	10799068001
צלחות ELISA	גריינר Bio-One, מיקרולון	655092
AffiniPure F(ab')2 פרגמנט עז אנטי-אנושי IgG, Fcγ פרגמנט ספציפי (לא מצומד)	ג'קסון מחקר חיסוני	109-006-008
חלב יבש 4% ללא שומן (חוסם כיתות ניקוי)	ביוראד	170-6404
IgG אנושי	סיגמא	I 2511	אימונוגלובולין מטוהר מסוג IgG אנושי, 5.6 מ"ג/מ"ל
עז F(ab)2 IgG Fcγ אנטי אנושי (מצומד עם peroxidase (PO))	ג'קסון מחקר חיסוני	109-036-008
קורא אליסה (פרקין אלמר 2030)	פרקין אלמר	2030-0050
AffiniPure Rabbit מצומד Peroxidase אנטי-אנושי IgM, Fc5μ	ג'קסון מחקר חיסוני	309-035-095
תאי SuperScript III מערכת סינתזת cDNA ישירה	Invitrogen	18080-200
מערכת PCR GeneAm 2700 של אפלייד ביוסיסטמס (ABI)	מערכות ביולוגיות יישומיות
ערכת בידוד RNA טהורה גבוהה	רוש	11828665001
ערכת מערכת תמלול לאחור	פרומגה	A3500
רקומביננטי Taq DNA פולימראז	טאקרה	R001A
פריימרים (2μl)	סיגמא
אגרוז טהור במיוחד	Invitrogen	16500-500
סולם 100 bp	Invitrogen	15628-019
כמות אחת 4.5.2 (ג'ל דוק 2000)	ביוראד	170-8100
ערכת טיהור PCR מהירה QIAquick	קיאגן	28106
ערכת רצף מחזור BigDye Terminator v3.1	מערכות ביולוגיות יישומיות	4337455
צלחת תגובה 0.1 מ"ל (MicroAMP אופטי 96-well)	מערכות ביולוגיות יישומיות	4346906
מנתח גנטי ABI300	מערכות ביולוגיות יישומיות	4346906
תאים מוכשרים DH5α (E. coli)	Invitrogen	18263-012
pFUSEss-CHIg-hG1 (4493 bp)	אינוויווגן	PFUSSS-HCHG1
pFUSEss-CHIg-hG4 (4484 bp)	אינוויווגן	PFUSESS-HCHG4
pFUSE2ss-CLIg-hk (3875 bp)	אינוויווגן	PFuse2SS-HCLK
pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3,883 כ"ס)	אינוויווגן	PFuse2SSS-HCLL2
מדיום SOC	Invitrogen	15544-034
מדיום אגר מבוסס LB בתוספת Zeocin (Fast-Media Zeo Agar)	אינוויווגן	FAS-ZN-S
מדיום נוזלי נהדר על בסיס מרק (שחפת) בתוספת Zeocin (Fast-Media Zeo TB)	אינוויווגן	FAS-ZN-L
ערכת DNA Miniprep	אומגה ביוטכנולוגיה	D6942-02
ננודרופ (ספקטרופוטומטר ND1000)	ננודרופ
מדיום אגר מבוסס LB בתוספת Blasticidin (אגר פיצוץ מדיה מהירה)	אינוויווגן	FAS-BL-S
מדיום נוזלי נהדר על בסיס מרק (שחפת) בתוספת Blasticidin (Fast-Media Blast TB)	אינוויווגן	FAS-BL-L
אקורי	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	R0101S	20,000 U/ml, ב-10x NEBuffer EcoRI
NheI	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	R0131S	10,000 U/ml, ב-10x NEBuffer 2.1
סולם DNA 2-Log	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	N3200S	0.1-10.0 קילו-בתים, 1,000 מיקרוגרם/מ"ל
XmaI	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	R0180S	10,000 U/ml, ב-10x CutSmart Buffer
BsiWI	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	R0553S	10,000 U/ml, ב-10x NEBuffer 3.1
אברII	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	R0174S	5,000 U/ml, ב-10x CutSmart Buffer
FastAP פוספטאז אלקליין רגיש לחום	תרמו סיינטיפיק	EF0651	U/μL אחד, ב-10x FastAP Buffer
תאים מוכשרים DH5α	Invitrogen	18263-012
עכבר PE IgG אנטי-אנושי	BD Pharmingen	555787
אנטי-CD22, PerCP-Cy5.5, שיבוט: HIB22	פישר סיינטיפיק	BDB563942
ערכת מיני-הכנה לספין QIAprep	קיאגן	27106
BigDye שליחות קטלנית v3.1	מערכות ביולוגיות יישומיות	4337455