טכנולוגיית Hybridoma לייצור נוגדנים חד-שבטיים כנגד מטלופפטידאז

תקציר

מקור: Xia, P., et al. ייצור נוגדנים חד-שבטיים המכוונים לאמינופפטידאז N באפיתל רירית המעי החזירי. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מדגים בדיקה לייצור נוגדנים חד-שבטיים נגד אמינופפטידאז חזירי N (APN), מטלופפטידאז הקשור לקרום, באמצעות טכנולוגיית היברידיומה מסורתית. עם חיסון עכבר עם APN, תאי הטחול נקצרים ומתמזגים עם תאי מיאלומה אלמותיים כדי לייצר היברידיות. לאחר מכן ההיברידיות נבחרות ומתפשטות באמצעות מדיום HAT (היפוקסנטין-אמינופטרין-תימידין) כדי לייצר נוגדנים חד-שבטיים ספציפיים לאפיטופים שונים של APN.

פרוטוקול

כל נהלי מודל בעלי החיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים וועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. חיסון בעלי חיים

1. עכברים תת-עוריים (s.c) מזריקים נקבות BALB/c, בנות 6-8 שבועות, עם 50 מיקרוגרם חלבון APN או מלח חוצץ פוספט (PBS, בקרה שלילית) מעורבב עם אדג'ובנטים אחת לשבועיים. השתמשו באדג'ובנט שלם של פרוינד המכיל את המיקובקטריה המושמדת בחום לחיסון ראשוני, ובאדג'ובנט לא שלם של פרוינד לחיסוני דחף. מערבבים נפחים שווים של חלבון APN (או PBS) ואדג'ובנט של פרוינד או אדג'ובנט לא שלם של פרוינד, בהתאמה.
2. זיהוי טיטרים של נוגדנים כנגד APN בסרה של עכברים אלה על ידי בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים עקיפה (ELISA) באמצעות צלחת מיקרוטיטר המצופה בחלבון APN של 5 מיקרוגרם / מ"ל מדולל ב- 0.05 M PBS (pH 9.6).

2. טכנולוגיית Hybridoma לייצור נוגדנים חד שבטיים נגד APN

1. תוך צפקית (כלומר) להזריק 100 מיקרוגרם של חלבון APN לעכברים שנבחרו לקבלת דחיפה סופית של אנטיגן.
2. שלושה ימים לאחר מכן, הרדימו את העכברים באמצעות נתרן pentobarbital (50 מ"ג / ק"ג, v/v, intraperitoneal) ונקע צוואר הרחם.
3. לאסוף טחול, ולשטוף עם DMEM פעמיים כדי להסיר תאי דם ושומן. סנן את מתלה תאי הטחול באמצעות רשת נחושת של 200 רשת כדי להסיר פסולת רקמות, וקצור תאי טחול באמצעות צנטריפוגה (1500 × גרם, 10 דקות) כדי להסיר את קרום הטחול.
4. תאי מיאלומה SP2/0 של עכבר זרעים בבקבוק²⁵ ס"מ 2 המכיל 5 מ"ל של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת 6% נסיוב בקר עוברי (FBS) ותרבית בטמפרטורה של 37°C, 6% CO₂ אטמוספירה לשמירה על כדאיות התא. לאחר 5-6 ימי תרבית, התאים מגיעים למפגש של 80%-90% לאחר החייאה ונמצאים בשלב יומן הגדילה. מתחת למיקרוסקופ, התאים עגולים, בהירים וצלולים.
5. יום לפני ההכלאה, אספו מקרופאגים מחללי הצפק של העכברים על פי שיטה שפורסמה בעבר.
6. מקרופאגים פריטוניאליים של זרעים בצפיפות של 0.1-0.2 × 10⁵/מ"ל בצלחות של 96 בארות, שכל באר מכילה 100 מיקרוליטר של מדיום HAT (DMEM בתוספת 10% FBS ותוסף HAT 1x), ודגרים ב 37 ° C, 6% CO₂ אטמוספירה לחה למשך הלילה.
7. להכלאה, יש לשאוף בעדינות תאי SP2/0 עם פיפטה מ-8-10 בקבוקים, ולהשהות ב-10 מ"ל של מדיום DMEM ללא סרום. לשטוף תאים עם DMEM טרי, צנטריפוגה (1500 × גרם, 10 דקות) פעמיים, ולאחר מכן להשעות מחדש ב 10 מ"ל של DMEM.
8. ערבבו את תאי הטחול המכומתים עם תאי SP2/0 ביחס של 10:1 והעבירו לצינורות של 50 מ"ל. צנטריפוגה (1500 × גרם, 10 דקות) ולהשליך את הסופרנטנט. אספו את כדורי התא בתחתית הצינורות וטפחו בכף היד כדי לשחרר את הכדוריות לפני ההכלאה.
9. יש להוסיף 1 מ"ל פוליאתילן גליקול 1500 (PEG 1500), שחומם מראש ל-37°C, ולטפטף באמצעות טפטפת לכדורית התא המשוחררת במשך פרק זמן של 45 שניות תוך סיבוב עדין של תחתית הצינור.
10. להוסיף באיטיות 1 מ"ל של DMEM שחומם מראש ל 37 ° C לתערובת לעיל במשך תקופה של 90 s, ואחריו עוד 30 מ"ל של DMEM טרי. הכניסו את צינור ההיתוך לאמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
11. לאחר הדגירה באמבטיה החמה, קוצרים את התאים ומשהים מחדש במדיום HAT. ואז תרבית בצלחת 96 באר מחוסנת במקרופאגים פריטוניאליים.
12. חמישה ימים לאחר מכן, להוסיף 100 μL של מדיום HAT טרי לכל באר, ולדגור על הצלחת במשך 5 ימים נוספים, ולאחר מכן להחליף את המדיום עם מדיום HT (DMEM בתוספת 10% FBS ו 1x HT תוספת).
13. השתמש בצלחת מיקרוטיטר המצופה בחלבון APN 5 מיקרוגרם/מ"ל מדולל ב- 0.05 M PBS (pH 9.6) כדי לנתח נוגדנים חד שבטיים בסופרנאטנט ההיברידי באמצעות בדיקת ELISA.
    1. כאשר התווך בבארות של צלחת 96 בארות הופך צהוב (עקב צמיחת תאים ושחרור מטבוליטים, pH בתווך יורד ל 6.8, ואדום פנול הופך מפוקסיה לצהוב) או אשכולות תאים נצפים, לרכוש 100 μL supernatant מן הבארות שנבחרו ולהוסיף בארות של צלחת ELISA מצופה. השתמש בקורא מיקרו-לוחות כדי למדוד את ערכי OD₄₅₀.
    2. השתמש בנוגדנים רב-שבטיים נגד APN וסרום עכבר לא נגוע כבקרה חיובית ושלילית, בהתאמה, והשתמש ב- PBS כבקרה ריקה. במחקר זה, יחס OD₄₅₀ בין דגימה לבקרה שלילית (P/N) ≥ 2.1 הוכר כתקן ברירה חיובית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
להשלים את האדג'ובנט של פרוינד	סיגמא-אולדריץ'	F5881	חיסון בעלי חיים
DMEM	גיבקו	11965092	תרבית תאים
DMEM-F12	גיבקו	12634010	תרבית תאים
ערכת ספירת תאים משופרת-8	ביוטכנולוגיה של ביוטיים	C0042	מדידת כדאיות התא וחיוניותו
סרום בקר עוברי	גיבקו	10091	תרבית תאים
גנטיצין™ אנטיביוטיקה סלקטיבית	גיבקו	11811098	אנטיביוטיקה סלקטיבית
תוסף HAT (פי 50)	גיבקו	21060017	בחירת תא
תוסף HT (100X)	גיבקו	11067030	בחירת תא
האדג'ובנט של פרוינד לא שלם	סיגמא-אולדריץ'	F5506	חיסון בעלי חיים
קורא Microplate	ביוטק	תיבה 998	ניתוח ELISA
פוליאתילן גליקול 1500	רוש דיאגנוסטיקה	10783641001	איחוי תאים
צלחת מיקרו 96 בארות	קורנינג	3599	תרבית תאים