שיטה לייצור נוגדנים רקומביננטיים נגד מטלופפטידאז

תקציר

מקור: Xia, P. et al., ייצור נוגדנים חד-שבטיים המכוונים לאמינופפטידאז N באפיתל רירית המעי החזירי.J. Vis. Exp.(2021)

סרטון זה מדגים הליך לייצור נוגדנים רקומביננטיים נגד מטלופפטידאז. פלסמידים רקומביננטיים הנושאים גנים לנוגדן, חלבון פלואורסצנטי ירוק ועמידות לאנטיביוטיקה נדבקים לתאי אפיתל עם ליפופקטמין. התאים הנגועים נבחרים ומעובדים כדי ליצור נוגדנים רקומביננטיים.

פרוטוקול

1. הכנת אנטיגן חלבון aminopeptidase N (APN) חזירי

הערה: זן pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) ותאי APN המבוטאים ביציבות pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 נבנו במחקר קודם.

1. יש לשחזר חיידקים ממלאי גליצרול קפוא ולפסוע על לוחות לוריא-ברטאני (LB) המכילים קנמיצין של 50 מיקרוגרם/מ"ל (ק"מ⁺) לבידוד מושבה יחידה.
2. בחר מושבה אחת מהצלחת המפוספסת הטרייה, תרבית ב 4 מ"ל של LB בינוני (10 גרם / ליטר טריפטון, 10 גרם / ליטר נתרן כלורי (NaCl) ו 5 גרם / ליטר תמצית שמרים, pH 7.2) בתוספת ^KM+ (50 מיקרוגרם / מ"ל), ולהשאיר לגדול לילה (12-16 שעות) עם תסיסה (178 סל"ד) ב 37 ° C.
3. לדלל את החיידקים המוכנים ב 1:100 בציר טרי ^KM+ LB ולדגור ב 37 ° C עם ניעור במשך 2-3 שעות עד OD₆₀₀ מגיע 0.4-0.6.
4. הוסף איזופרופיל β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) לריכוז הסופי עד לריכוז סופי של 0.4 mM, ודגר על התרביות במשך 10 שעות נוספות ב 16 °C.
5. כתוצאה מכך, צנטריפוגה וקצירת החיידקים באמצעות אינדוקציה IPTG (10,000 × גרם, 4 ° C 15 דקות).
6. יש להשהות מחדש את גלולת התא באמצעות 5 מ"ל של חיץ LEW (Lysis/Equilibration/Wash) (50 mM נתרן פוספט מונובסיסי נטול מים (NaH₂PO₄) ו-300 mM NaCl, pH 8.0) המכיל 1 מ"ג/מ"ל ליזואנזים. ערבבו את המתלה החיידקי במשך 30 דקות על קרח ובצעו סוניקציה מלאה (פעימה של 15 שניות ו-20 שניות כיבוי, 15 דקות) באמצעות הומוגנייזר על-קולי.
7. צנטריפוגה את הליזט התא הגולמי ב 4 ° C ו 10,000 × גרם במשך 30 דקות כדי להסיר פסולת תאית. מעבירים סופרנאטנט לטור מאוזן מראש ודוגרים 1-2 דקות לפני ניקוז כוח הכבידה. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
8. שטפו את העמוד באמצעות 20 מ"ל של חיץ LEW ונקזו באמצעות כוח הכבידה. יש להקפיד על חלבון APN המתויג בהיסטידין באמצעות 9 מ"ל של חיץ אלוציה (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl ו-250 mM imidazole, pH 8.0) ולאסוף לתוך צינורות דיאליזה.
9. יש לנטרל את תמיסת החלבון למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C במאגר נתרן פחמתי-נתרן דו-פחמתי (פוספט-חוצץ מלוחים (PBS), 135 mM NaCl, 4.7 mM אשלגן כלורי, 2 mM NaH₂PO₄ ו-10 mM dodecahydrate sodium phosphate dibasic, pH 7.2).
10. יש לנתח באמצעות ג'ל SDS-PAGE 12.0% וכתמים מערביים כדי להעריך את טוהר חלבון APN.
    1. לטעון 5 מיקרוגרם של חלבון לתוך כל באר של הג'ל ולאפשר לרוץ ב 110 V במשך 1.5 שעות. לאחר מכן, העבירו חלבון לקרום פוליווינילידן פלואוריד (PVDF) למשך 50 דקות ב-15 וולט. קבעו את ריכוז החלבון המטוהר באמצעות בדיקת חומצה ביכונית
    .

2. חיסון בעלי חיים

1. עכברים תת-עוריים (s.c) מזריקים נקבות BALB/c בגיל 6-8 שבועות, עם 50 מיקרוגרם חלבון APN או PBS (בקרה שלילית) מעורבבים עם אדג'ובנטים אחת לשבועיים. השתמשו באדג'ובנט שלם של פרוינד המכיל את המיקובקטריה המושמדת בחום לחיסון ראשוני, ובאדג'ובנט לא שלם של פרוינד לחיסוני דחף. מערבבים נפחים שווים של חלבון APN (או PBS) ואדג'ובנט של פרוינד או אדג'ובנט לא שלם של פרוינד, בהתאמה.
2. זיהוי טיטרים של נוגדנים כנגד APN בסרה של עכברים אלה על ידי בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים עקיפה (ELISA) באמצעות צלחת מיקרוטיטר המצופה בחלבון APN של 5 מיקרוגרם / מ"ל מדולל ב- 0.05 M PBS (pH 9.6).

3. טכנולוגיית Hybridoma לייצור נוגדנים חד-שבטיים נגד APN

1. תוך צפקית (כלומר) להזריק 100 מיקרוגרם של חלבון APN לעכברים שנבחרו לקבלת דחיפה סופית של אנטיגן.
2. שלושה ימים לאחר מכן, הרדימו את העכברים באמצעות נתרן pentobarbital (50 מ"ג / ק"ג, v/v, intraperitoneal) ונקע צוואר הרחם.
3. אספו טחול, ושטפו עם מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) פעמיים כדי להסיר תאי דם ושומן. סנן את מתלה תאי הטחול באמצעות רשת נחושת של 200 רשת כדי להסיר פסולת רקמות, וקצור תאי טחול באמצעות צנטריפוגה (1500 × גרם, 10 דקות) כדי להסיר את קרום הטחול.
4. תאי מיאלומה SP2/0 של עכבר זרע בבקבוק²⁵ ס"מ 2 המכיל 5 מ"ל DMEM בתוספת 6% סרום בקר עוברי (FBS) ותרבית בטמפרטורה של 37°C, 6% פחמן דו חמצני (CO₂) אטמוספירה לשמירה על כדאיות התא. לאחר 5-6 ימי תרבית, התאים מגיעים למפגש של 80%-90% לאחר החייאה ונמצאים בשלב יומן הגדילה. מתחת למיקרוסקופ, התאים עגולים, בהירים וצלולים.
5. יום לפני ההכלאה, אספו מקרופאגים מחללי הצפק של העכברים על פי שיטה שפורסמה בעבר.
6. מקרופאגים פריטוניאליים של זרעים בצפיפות של 0.1-0.2 × 10⁵/mL בצלחות של 96 בארות, כל באר מכילה 100 μL של היפוקסנטין-אמינופטרין-תימידין (HAT) בינוני (DMEM בתוספת 10% FBS ותוסף HAT 1x), ודגרים ב 37 ° C, 6% CO₂ אטמוספירה לחה למשך הלילה.
7. להכלאה, יש לשאוף בעדינות תאי SP2/0 עם פיפטה מ-8-10 בקבוקים ולהשהות ב-10 מ"ל של מדיום DMEM ללא סרום. לשטוף תאים עם DMEM טרי, צנטריפוגה (1500 × גרם, 10 דקות) פעמיים, ולאחר מכן להשעות מחדש ב 10 מ"ל של DMEM.
8. ערבבו את תאי הטחול המכומתים עם תאי SP2/0 ביחס של 10:1 והעבירו לצינורות של 50 מ"ל. צנטריפוגה (1500 × גרם, 10 דקות) ולהשליך את הסופרנטנט. אספו את כדורי התא בתחתית הצינורות וטפחו בכף היד כדי לשחרר את הכדוריות לפני ההכלאה.
9. יש להוסיף 1 מ"ל פוליאתילן גליקול 1500 (PEG 1500), שחומם מראש ל-37°C, ולטפטף באמצעות טפטפת לכדורית התא המשוחררת במשך פרק זמן של 45 שניות תוך סיבוב עדין של תחתית הצינור.
10. להוסיף באיטיות 1 מ"ל של DMEM שחומם מראש ל 37 ° C לתערובת לעיל במשך תקופה של 90 s, ואחריו עוד 30 מ"ל של DMEM טרי. הכניסו את צינור ההיתוך לאמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
11. לאחר הדגירה באמבטיה החמה, קוצרים את התאים ומשהים מחדש במדיום HAT. ואז תרבית בצלחת 96 באר מחוסנת במקרופאגים פריטוניאליים.
12. חמישה ימים לאחר מכן, להוסיף 100 μL של מדיום HAT טרי לכל באר, ולדגור על הצלחת במשך 5 ימים נוספים, ולאחר מכן להחליף את המדיום עם מדיום HT (DMEM בתוספת 10% FBS ו 1x HT תוספת).
13. השתמש בצלחת מיקרוטיטר המצופה בחלבון APN 5 מיקרוגרם/מ"ל מדולל ב- 0.05 M PBS (pH 9.6) כדי לנתח נוגדנים חד שבטיים בסופרנאטנט ההיברידי באמצעות בדיקת ELISA.
    1. כאשר התווך בבארות של צלחת 96 בארות הופך צהוב (עקב צמיחת תאים ושחרור מטבוליטים, pH בתווך יורד ל 6.8, ואדום פנול הופך מפוקסיה לצהוב) או אשכולות תאים נצפים, לרכוש 100 μL supernatant מן הבארות שנבחרו ולהוסיף בארות של צלחת ELISA מצופה. השתמש בקורא מיקרו-לוחות כדי למדוד את ערכי הצפיפות האופטית 450 (OD450).
    2. השתמש בנוגדנים רב-שבטיים נגד APN וסרום עכבר לא נגוע כבקרה חיובית ושלילית, בהתאמה, והשתמש ב- PBS כבקרה ריקה. במחקר זה, יחס OD450 בין דגימה לבקרה שלילית (P/N) ≥ 2.1 הוכר כתקן ברירה חיובית.
14. לאחר שלושה סבבי בחירה חיוביים רצופים, בחר את ההיברידיומה המציגה תגובה סרולוגית מוגברת כנגד חלבון APN לבדיקת דילול מוגבלת.
    1. הכינו מקרופאגים פריטוניאליים וזרעים בצלחות 96 בארות כפי שתואר קודם לכן.
    2. להשהות תאי hybridoma בתווך HT בממוצע של 0.5-2 תאים לבאר ותרבית ב 37 ° C, 6% CO₂ אינקובטור. חזור על שלב זה שלוש או ארבע פעמים עד שיעור חיובי שצוין על ידי ELISA immunoassay מגיע 100%.
15. תחת לחץ של הקפאה והפשרה מתמשכות, בחר את תאי ההיברידיומה החיוביים המסוגלים להפריש ביציבות נוגדנים נגד APN ולהתרבות באופן נורמלי.
    1. יש לבצע זריקה בודדת של 0.3 מ"ל פריסטן לכל עכבר (8-10 שבועות). לאחר 10 ימים לאחר קבלת בתולי, להזריק לכל עכבר 2-5 x 10⁵ תאים היברידיים ב 0.5 מ"ל של PBS (pH 7.2).
    2. בזהירות לאסוף נוזל הצפק מחלל הצפק של עכברים אלה 8 עד 10 ימים לאחר ההזרקה.
    3. קצרו את הסופרנאטנטים על ידי צנטריפוגה ב-5,000 × גרם למשך 15 דקות וטיהרו נוגדנים בסופרנאטנטים באמצעות 33% אמוניום סולפט רווי [(NH₄)₂SO₄] משקעים וחלבון A אגרוז.

4. אפיון נוגדנים חד שבטיים (mAbs) כנגד חלבון APN

1. קבע את תת-סוג האימונוגלובולינים של ה- mAbs שנאסף באמצעות מערכת קלונוטיפינג SBA - HRP. השתמש ב-SDS-PAGE ובכתמים מערביים כדי להעריך את הטוהר והספציפיות של mAb.
2. נתח את הספציפיות של אפיטופ mAb מול חלבון APN באמצעות ELISA. ערך תוספתי (AV) הוא היחס בין OD_{mAbs (a+b)} ל- (OD_mAbs-a+OD_mAbs-b), המשמש להערכה אם mAbs מזהה את אותו אתר אנטיגני; OD_mAbs-a ו_{- OD mAbs-b} מייצגים את ערכי OD450 של נוגדנים חד-שבטיים שונים כנגד APN בלבד, ו- OD_{mAbs (a+b)} מייצגים את ערכי OD450 של תערובת 1:1 של שני mAbs כנגד APN.
   1. להעריך כל מדגם לפחות ארבעה עותקים משוכפלים ולחזור על כל הניסוי לפחות שלוש פעמים.

5. ביטוי של rAbs נגד APN

1. חלצו את סך כל הרנ"א מתאי ההיברידיומה והטחול שהוזכרו לעיל של עכברים שחוסנו נגד APN (למשל, TRIzol). סנתז DNA משלים (cDNA) באמצעות ערכת סינתזת cDNA בהתאם להוראות היצרן.
2. הגבירו אזורים משתנים של mAbs באמצעות תגובת שרשרת פולימראז מקוננת (PCR) וקבעו רצפי שרשרת כבדה (VH) ושרשרת קלה (VL) באמצעות ריצוף. נתח את הגנים המקודדים VH ו- VL באמצעות כלי ניתוח הגנום של עכבר IMGT (http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php).
3. שלב את הגנים VH ו- VL עם רצפים מובילים ושכפל אותם ברצף לווקטורים pET28a (+) ו- pIRES2-ZsGreen1, בהתאמה, תוך שימוש בטכנולוגיית שיבוט חלקה כדי לאפשר החדרת מקטעי DNA ללא צלקת. הפריימרים הספציפיים מפורטים בטבלה 1.
4. גדל את החיידקים pET28a (+)-rAbs-APN-BL21-transformed בנוכחות 0.4 mM IPTG בשייקרים מסלוליים ב 37 ° C במשך 10 שעות. לאחר מכן השרה, טיהור והערכה של ביטוי חלבון rAbs באמצעות טיהור חלבון שגרתי.
5. זרעו 100 μL 0.5 x 10⁵ תאי CHO לכל באר לתוך צלחת 96 באר ודגרו ב 37 ° C באטמוספירה 6% CO₂ במשך 18-24 שעות. כאשר התאים מגיעים למפגש של 80-90%, יש לדלל את פלסמיד pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN עם Opti-MEM לריכוז סופי של 0.1 מק"ג/μL, ולדגור 5 דקות בטמפרטורת החדר לפני השימוש לטרנספקציה.
6. ערבבו בעדינות 50 μL של פלסמיד pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN מדולל עם 1 μL של Lipofectamine 2000 ו-49 μL של Opti-MEM ודגרו על התערובת במשך 20 דקות נוספות בטמפרטורת החדר. הוסף 100 μL של תערובת לכל באר של צלחת 96 בארות המכילה תאי CHO ודגור ב 37 ° C ב 6% CO₂ אטמוספירה במשך 4-6 שעות.
7. ב 4-6 שעות לאחר transfection, להחליף את המדיום עם מדיום DMEM-F12 בתוספת 10% FBS, ולדגור את הצלחת עוד 48 שעות. לאחר מכן, הוסף 400 מיקרוגרם / מ"ל G418 לכל באר כדי לבחור את התאים הנגועים ביציבות.
8. לאחר 10 ימים של בחירה באמצעות מדיום DMEM-F12 בתוספת 10% FBS ו- 400 מיקרוגרם/מ"ל G418, מיין את התאים (3.0 × 10⁷ תאים/מ"ל) לפי מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות. כ-10-15% מאוכלוסיית התאים היו חיוביים.
9. תאים חיוביים שנקטפו בדילול סריאלי, זרעים בממוצע של 0.5-2 תאים לבאר בצלחת של 96 בארות, ותרבית באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 6% CO₂. שמור על תאי pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO הנגועים ביציבות באמצעות בחירה עם G418 (200 מיקרוגרם/מ"ל).
10. ריכוז FBS בתווך תרבית התאים המתואר לעיל יורד בהדרגה מ -10% ל -0% במהלך שלב הגידול הלוגריתמי על פני תקופת זמן של 3 שבועות. לאחר מכן, התאימו את תאי ה-CHO הנצמדים לצמיחת תרחיף בתווך נטול סרום.
11. תרבית את תאי pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO בשלב הגידול הלוגריתמי בתווך נטול סרום בצפיפות של 0.8-1.0 ×^{10 5} תאים/מ"ל בצלוחיות טלטול במהירות ניעור של 80-110 סל"ד ו-37°C, 6% CO₂.
12. אסוף את תרחיף התא כל 12 שעות כדי לקבוע שינויים בכדאיות התא ובחיוניותו באמצעות ערכת ספירת תאים (לדוגמה, CCK-8) בהתאם להוראות היצרן.
13. ביטוי נוגדנים מגיע לרמות שיא כאשר כדאיות התא ירדה ל -80% וצפיפות התא מגיעה ל 1.0-2.0 ×^{10 6} תאים / מ"ל. קצרו סופרנאטנטים של תאים באמצעות צנטריפוגה, סננו באמצעות מסנן קרום פוליטטרה-פלואוראתילן 0.22 מיקרומטר, וטיהרו באמצעות חלבון A אגרוז.
14. אשר ייצור של נוגדנים ספציפיים ל-APN באמצעות בדיקות עקיפות של immunofluorescence (IFA).
15. קבע טיטרים של נוגדנים וזיקות קשירה באמצעות בדיקת ELISA כפי שתואר קודם לכן. חישוב קבוע דיסוציאציה של שיווי משקל (ערך_{K D}) של הנוגדנים באמצעות משוואה לוגיסטית בת ארבעה פרמטרים באמצעות תוכנה.

טבלה 1. הפריימרים הספציפיים שבהם נעשה שימוש במחקר זה.

תחל	רצף (5'-3')
VH-VL-F	CCGGGTGGGCCGGATAGACMGATGGGGCTG
VH-VL-R	CCGGCCACATAGGCCACTTGACATTGATGT
pET28a (+)-F	TCCACCAGTCATGCTAGCCATAACAACGGTCGTGATTCGA
pET28a (+)-R	CTGGTGCCGCGCGGCAGCCAGTGGGATACCCGTATTACCC
pIRES2-ZsGreen1-F	CGACGGTACCGCGGGCGGTAACAACGGTCGTGATTCGA
pIRES2-ZsGreen1-R	GGGGGGGAGGGGGGGCGGTGGGATACCCGTATTACCC

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
להשלים את האדג'ובנט של פרוינד	סיגמא-אולדריץ'	F5881	חיסון בעלי חיים
דאפי	ביוטכנולוגיה של ביוטיים	C1002	כתם נגד גרעיני
DMEM	גיבקו	11965092	תרבית תאים
DMEM-F12	גיבקו	12634010	תרבית תאים
Dylight 549-conjugated עז נגד עכבר נוגדן משני IgG	אבקין	A23310	ניתוח עקיף של immunofluorescence
ערכת ספירת תאים משופרת-8	ביוטכנולוגיה של ביוטיים	C0042	מדידת כדאיות התא וחיוניותו
סרום בקר עוברי	גיבקו	10091	תרבית תאים
גנטיצין™ אנטיביוטיקה סלקטיבית	גיבקו	11811098	אנטיביוטיקה סלקטיבית
תוסף HAT (פי 50)	גיבקו	21060017	בחירת תא
תוסף HT (100X)	גיבקו	11067030	בחירת תא
האדג'ובנט של פרוינד לא שלם	סיגמא-אולדריץ'	F5506	חיסון בעלי חיים
איזופרופיל β-d-1-thiogalactopyranoside	סיגמא-אולדריץ'	I5502	ביטוי חלבונים
קנמיצין	ביוטכנולוגיה של ביוטיים	ST102	אנטיביוטיקה חיידקית
מיקרוסקופ קונפוקלי Leica TCS SP8 STED	לייקה מיקרוסיסטמס	SP8 STED	הדמיה פלואורסצנטית
מגיב Lipofectamine® 2000	תרמופישר	11668019	טרנספקציה
מיון תאים המופעלים על ידי LSRFortessa™ פלואורסצנטיות	ב.ד.	FACS LSRFortessa	ציטומטריית זרימה
קורא Microplate	ביוטק	תיבה 998	ניתוח ELISA
מיקרו ספקטרופוטומטר	תרמו פישר	ננו דרופ אחד	זיהוי ריכוז חומצות גרעין
NaCl	סינופארם מגיב כימי	10019308	מרק תרבות
(NH4)2SO4	סינופארם מגיב כימי	10002917	מרק תרבות
Opti-MEM	גיבקו	31985088	תרבית תאים
פוליאתילן גליקול 1500	רוש דיאגנוסטיקה	10783641001	איחוי תאים
ערכת סינתזת cDNA של גדיל ראשון PrimeScript™	טאקרה ביו	$047	qPCR
חלבון A אגרוז	ביוטכנולוגיה של ביוטיים	עמ' 2006	טיהור חלבון נוגדנים
Protino® Ni+-TED 2000 עמודות ארוזות	מכרי-נגל	745120.5	טיהור חלבונים
SBA Clonotyping System-HRP	סאות'רן ביוטק	מאי-00	איזוטיפ של נוגדנים חד-שבטיים בעכבר
ערכת שכפול חלקה	ביוטכנולוגיה של ביוטיים	D7010S	בניית פלסמידים
נערו צלוחיות	ביוטכנולוגיה של ביוטיים	E3285	תרבית תאים
חיץ נתרן פחמתי-סודיום ביקרבונט	ביוטכנולוגיה של ביוטיים	C0221A	תרבית תאים
תא העברה חצי יבש SD Trans-Blot	ביו-ראד	170-3940	כתם מערבי
טריפטון	אוקסואיד	LP0042	מרק תרבות
הומוגנייזר קולי	Ningbo Xinzhi ביוטכנולוגיה	JY92-IIN	הומוגניזציה לדוגמה
תמצית שמרים	אוקסואיד	LP0021	מרק תרבות
צלחת מיקרו 96 בארות	קורנינג	3599	תרבית תאים