בדיקת הפעלה מלאכותית במבחנה לחקר הפעלת קולטן Fc על ידי נוגדנים

תקציר

מקור: Petriello, A. et al. הערכה של אירועי תאי הרג טבעיים אנושיים המונעים על ידי מעורבות FcγRIIIa בנוכחות נוגדנים טיפוליים. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים אירועים המונעים על ידי FcγRIIIa המופעלים על ידי נוגדנים טיפוליים בתאי הרג טבעיים אנושיים. פלטפורמת הגירוי המלאכותי מאפשרת חקירה של פונקציות השפעה במורד הזרם, וכוללת סידור מחדש של שלד ציטו-שלד, דה-גרנולציה, ייצור כימוקין/ציטוקינים ומסלולי איתות המתווכים על ידי חלקי FcγRIIIa ו-Fc של נוגדנים המעורבים בקשירה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. בידוד PBMCs והעשרה/טיהור תאי NK

הערה: ניתן לבצע גם שיטות אחרות לבידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) ולהעשרה/טיהור.

1. לשאוב 200 מ"ל של דם בתנאים מוסדרים לתוך צינור המכיל הפרין.
2. הוסף 15 מ"ל של מדיום שיפוע הצפיפות לתוך צינור 50 מ"ל עם מחסום נקבובי משולב. סובב את הצינור ב 1000 x גרם במשך 30 שניות.
3. הוסף 12.5 מ"ל דם לתוך הצינור, ואחריו עוד 12.5 מ"ל של PBS, והפוך בעדינות 3x. סובב את הצינור ב 800 x גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ללא הפסקות.
4. הכינו צינור חרוטי 50 מ"ל עם 40 מ"ל PBS לכל צינור עם מחסום נקבובי בזמן שהתאים מסתובבים.
5. בזהירות להסיר את הצינורות ולבדוק לאחר צנטריפוגה. בדוק אם קיימת שכבה דקה ולבנה של PBMCs מעל המחסום הנקבובי, בין התיחום של 20 מ"ל ל-25 מ"ל בצינור של 50 מ"ל.
6. יש להסיר בזהירות כמה שיותר נוזלים מהחלק העליון באמצעות פיפטה מבלי להפריע לשכבת PBMC הדקה והלבנה.
7. עם פיפטה סרולוגית נקייה של 10 מ"ל, הסר בעדינות את שכבת PBMC בנוסף לשכבה הנוזלית השקופה והצהבהבה עד לפילטר של הצינור.
8. יש לגרש את ה-PBMCs והנוזל לתוך החרוט 50 מ"ל המכיל PBS שהוכן בשלב 1.4. סובב צינורות ב RT ו 300 x גרם במשך 5 דקות.
9. שאפו לשטוף PBS ולהוסיף 40 מ"ל נוספים של PBS. סובב צינורות ב RT ו 300 x גרם במשך 5 דקות.
10. לאחר השטיפה, ספרו את התאים והשהו אותם מחדש ב-40 μL של 2% BSA/PBS לכל 1 x 10⁷ תאים.
11. המשך לבידוד של תאי NK באמצעות שיטת הבחירה. האפשרויות כוללות מיון ידני או אוטומטי מבוסס חרוזים מגנטיים. ניתן לבצע גם מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות.
12. הסר aliquot קטן של תאים כדי לקבוע את הטוהר של תאי NK על ידי ציטומטריית זרימה. אסטרטגיית Gating כוללת את הדברים הבאים: שער על תאים חיים בהתבסס על פרופיל פיזור קדימה לעומת צד, ולאחר מכן להעריך את הטוהר בהתבסס על סמני NK (למשל, CD3, CD56) באוכלוסייה החיה הספציפית. טוהר אופייני הוא >95%.
13. לאחר השלמת הבידוד, סובבו תאים ב-RT וב-300 x g במשך 5 דקות כדי לשאוף ולשאוף.
14. השהה מחדש את גלולת התא ל 1 x 10⁷ תאים / מ"ל בסל"ד 1640 עם חומרים מזינים, 10% FBS מומת חום, 1 mM נתרן פירובט, 55 mM 2-ME, ו 10 mM HEPES (pH = 7.2).

2. הפעלה בתיווך נוגדנים של תאי NK באמצעות FcγRIIIa

1. הגדר מיקרוצנטריפוגה בקירור ל 4 ° C.
2. יש להוציא 1 x 10⁶ (100 μL של) תאי NK מרחפים לתוך צינור(ות) 1.5 מ"ל ולהניח על ice.
   הערה: תאים ניתן לחלק לתוך צלחת 96 באר U-תחתית אם יש דגימות רבות.
3. הכן 1 μL של 100 מיקרוגרם / מ"ל rituximab (או נוגדן עניין) לכל דגימה ולהוסיף 1 μL לתאים לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ"ל נוגדן.
   הערה: מולקולות אחרות ניתן להוסיף לתאים בשלב זה או מוקדם יותר להערכת השפעות משולבות. כאן, ritixumab שימש לגירוי. במחקרים קודמים נוספו מעכבי מולקולות קטנות לגירויים.
4. לדגור את הדגימה על קרח במשך 30 דקות. במהלך הדגירה, להכין 50 μL של 50 מיקרוגרם / מ"ל נוגדן שרשרת אור κ אנטי אנושי לכל דגימה במדיה וחם ל 37 ° C על בלוק חום או באמבט מים.
5. לאחר הדגירה של תאים על קרח, להוסיף 1 מ"ל של מדיה קרה כקרח ולהסתובב ב 135 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לשטוף שוב עם 1 מ"ל של מדיה קרה כקרח.
6. שאפו את הסופרנאטנט לאחר השטיפה האחרונה והוסיפו 50 μL של תערובת שרשרת האור κ אנטי-אנושית שהוכנה בשלב 2.4.
7. יש לדגור מיד על דגימות עבור נקודות הזמן שנקבעו על-ידי משתמש הקצה ב-37°C בבלוק חום או באמבט מים.
8. עצור את הגירוי על ידי הוספת 1 מ"ל של מדיה קרה כקרח ומיד סובב דגימות בצנטריפוגה מקוררת ב 135 x גרם במשך 5 דקות. לשטוף פעם נוספת עם 1 מ"ל של מדיה קרה כקרח.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
16% פרפורמאלדהיד	תרמו פישר סיינטיפיק	50-980-487
אלקסה פלואור 488 פלואידין	תרמו פישר סיינטיפיק	A12379
נוגדן HRP נגד עכברים	טכנולוגיות איתות תאי	7076
מכשיר AutoMACS	מילטני		שיטת בידוד תאי NK; ניתן להשתמש בכלי בידוד אחר
נוגדן APC CD107a	ביואגדה	328620
סרום בקר אלבומין חלק V, ללא חומצות שומן	מיליפור סיגמא	10775835001
ציטוקין 30-Plex פאנל אנושי	תרמו פישר סיינטיפיק	LHC6003M	ניתן להשתמש בשיטת כימוקין/ציטוקינים אחרת; ניתן להשתמש בשיטת ניתוח כימוקין/ציטוקינים אחרת
FBS (סרום בקר עוברי)	היקלון	SH30071.01
עז אנטי אדם κ שרשרת אור נוגדן	מיליפור סיגמא	AP502
עצירת קוקטייל מעכבי פרוטאז ופוספטאז	תרמו פישר סיינטיפיק	78440
נוגדן pAKT (S473)	טכנולוגיות איתות תאי
נוגדן pERK1/2	טכנולוגיות איתות תאי
נוגדן pPRAS40	טכנולוגיות איתות תאי	13175
נוגדן HRP β-אקטין	אבקאם	dorit_19771
ערכת בידוד תאי NK	מילטני	130-092-657	ערכת בידוד תאי NK; ניתן להשתמש בערכת בידוד נוספת