טכניקה ליצירת נוגדנים חד-שבטיים מתאי B ספציפיים לאנטיגן

תקציר

מקור: Devilder, M., et al. דור של נוגדנים חד-שבטיים אנושיים מפלים מתאי B נדירים ספציפיים לאנטיגן המסתובבים בדם. J. Vis. Exp. (2018).

הסרטון מדגים טכניקה ליצירת נוגדנים חד-שבטיים מתאי B ספציפיים לאנטיגן. וקטורי ביטוי אאוקריוטים המקודדים את השרשראות הכבדות והקלות של נוגדנים, המשובטים מתאי B ספציפיים לאנטיגן מבודדים, מוחדרים לתאי יונקים באמצעות פוליפלקסים. ברגע שהם בתוך התאים, וקטורים אלה עוברים תרגום, ופפטידים כבדים וקלים של שרשרת מתאספים לנוגדנים, אשר מופרשים לאחר מכן על ידי התאים.

פרוטוקול

1. ייצור mAbs

1. יום לפני הטרנספקציה, זרעו 15,000 תאי כליה עוברית אנושית 293A (HEK 293A) ב 200 μL של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% FBS לכל באר בצלחות 96 באר. יש לדגור לילה באינקובטור CO₂ (5% CO₂) בטמפרטורה של 37°C.
2. תאי Cotransfect 293A בתווך DMEM המכילים 10% FBS באמצעות נגזרת פוליאתילנימין ליניארית כמגיב טרנספקציה.
   הערה: בצע את transfection ב triplicates. הפרוטוקול הבא הוא עבור באר אחת של צלחת תחתונה שטוחה 96 בארות.
   1. לדלל 0.5 μL של מגיב טרנספקציה DNA לתוך 10 μL של 150 mM NaCl. לדלל 0.125 מיקרוגרם של שרשרת כבדה משתנה (vH) ו 0.125 מיקרוגרם של שרשרת אור משתנה (vL) המבטא וקטורים לתוך 10 μL של 150 mM NaCl. מערבול כל דילול במשך 10 שניות.
   2. הוסף מגיב טרנספקציה של DNA מדולל 10 μL לתמיסת DNA של 10 μL. מערבלים 15 שניות ודוגרים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. מוסיפים את תערובת 20 μL טיפה על תאים 293A, ומערבבים על ידי ערבול עדין של הצלחת.
3. החלף את התווך 16 שעות לאחר טרנספקציה ותאי תרבית במשך 5 ימים במדיום ללא סרום.
   הערה: השתמש בתווך ללא סרום כדי למנוע אימונוגלובולינים בסרום (Igs) מזהמים את הנוגדנים המיוצרים.
4. סלק תאים ופסולת על ידי צנטריפוגה ב 460 x גרם במשך 5 דקות.
5. קוצרים סופרנאטנטים על ידי שאיפה עם פיפטה רב ערוצית ומעבירים אותם לצלחת V תחתית 96 בארות.
6. ציפוי Ag רלוונטי למשך הלילה ב 4 ° C ב 100 μL לכל באר של שחזור אנזים מקושר immunosorbent assay (ELISA) / אנזים מקושר immunosorbent spot (ELISPOT) ציפוי חיץ 1x בריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ"ל בלוחות ELISA 96 באר.
7. לחסום בארות עם 10% FBS DMEM בינוני במשך 2 שעות ב 37 ° C.
8. הוסף 50 μL של supernatants של תאים 293A נגועים משלב 1.5, ולדגור במשך 2 שעות ב RT.
9. יש להוסיף 100 μL של נוגדן אנטי-אנושי מסוג אימונוגלובולין G (IgG Ab) מצומד לאנזים פרוקסידז חזרת (HRP) במינון של 1 מיקרוגרם/מ"ל ולדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. מוסיפים 50 μL מצע כרומוגני (3,3',5,5' tetramethylbenzidine, TMB), ודגרים במשך 20 דקות.
10. קרא צפיפויות אופטיות של 450 ננומטר בספקטרופוטומטר.
    הערה: ה- mAbs הספציפיים שנחשפו על ידי בדיקת ELISA יכולים להיות מיוצרים בקנה מידה גדול ומטוהרים על עמודת חלבון A המציגה זיקה ל- IgG אנושי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קו תאים HEK 293A	תרמו פישר מדעי	₪17507
DMEM (1X) מדיום הנשר המעובד של Dulbecco	Gibco by life technologies	21969-035	(+) 4,5g/l D-גלוקוז 0,11g/L נתרן פירובט (-) ל-גלוטמין
Nutridoma-SP	רוש	11011375001	100X Conc
סרום בקר עוברי (FBS)	דומיניק דוטשר	S1810-500
מגיב טרנספקציה של DNA Jet PEI	פוליפלוס	101-40
צלחת שטוחה תחתונה 96 באר	בז	353072
צלחת V תחתונה 96 באר	Nunc/Thermofisher	55142