העברה משופרת של נוגדנים למוח עכבר

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת צנתרי השלב

1. הכנת צינור סיליקה מאוחה לשלב הצנתר
   1. חותכים את נימי הסיליקה המאוחים בקוטר פנימי של 0.1 מ"מ ועובי דופן של צינורות 0.0325 מ"מ לאורך של 30 מ"מ.
   2. בדקו את הצינור לאיתור סדקים וליטשו בחום את הקצוות באמצעות מיקרופורג' כדי לוודא שלפתחי הצינור יש משטח חלק.
2. קיבוע הצינור הפנימי במחט מתכת
   1. הרכיבו מחט 27 גרם על מזרק 10 מיקרוליטר והניחו את המזרק ברובוט סטריאוטקטי.
   2. באמצעות הרובוט, להזיז את המזרק על משטח קשה ולגעת בו עם קצה המחט. יש לציין או לשמור מיקום זה בתוכנה מכיוון שהוא ישמש כמשטח ייחוס לקביעת אורך שלב הצנתר.
   3. הרימו את המחט כדי לאפשר לנימי הסיליקה המאוחים להיות ממוקמים בתוך המחט.
   4. מניחים את נימי הסיליקה המאוחים במחט כך ש-20 מ"מ מהנימים בולטים מהמחט.
   5. באמצעות פיפטה, פיזר באופן שווה 2 μL של דבק ציאנואקרילט בצמיגות גבוהה מעל הנימים, החל ממחט המתכת ועד 10 מ"מ מעל הקצה התחתון של הנימים, כפי שמתואר באיור 1.
   6. באמצעות הרובוט הסטריאוטקטי, הנמיכו את המחט עד שקצה מחט המתכת יהיה 1 מ"מ מעל משטח הייחוס. בדרך זו, נימי סיליקה מאוחה יהיה קבוע במחט מתכת, יצירת צעד 1 מ"מ מן הקצה. הסר את עודפי הדבק הנוצרים בקצה מחט המתכת כדי למנוע הקהות את המדרגה.
   7. המתינו 15 דקות עד שהדבק יתקשה, והוציאו את המזרק עם הצנתר מהרובוט הסטריאוטקטי. ודא שכל עודפי הדבק הוסרו בשלב על ידי בדיקת קצה הצנתר תחת מיקרוסקופ.
3. בדיקת צנתר הצעד באמצעות גוש אגרוז
   1. הכינו תמיסת אגרוז 0.6% במי מלח חוצצים פוספט (PBS) במגש ג'ל רגיל והמתינו עד שהיא מתפלמנת. חותכים את האגרוז בבלוקים של כ 20 מ"מ x 20 מ"מ. עד לשימוש, שמור את הבלוקים שקועים ב- PBS.
   2. מלא ידנית את מזרק צנתר צעד עם 10 μL של 0.4% תמיסה של טריפאן כחול מסונן.
   3. באמצעות הרובוט הסטריאוטקטי, יש לפזר 1 μL ב-0.2 μL/min כדי להעריך את איטום שלב הצנתר במהלך הליך הקיבוע. תמיסה כחולה טריפאן צריכה להיות גלויה אך ורק על קצה הצנתר. נגבו אותו עם ממחטת נייר.
   4. מניחים את בלוק האגרוז ברובוט הסטריאוטקטי ומכיילים את הרובוט כך שקצה הצנתר מופנה כנגד פני השטח של בלוק האגרוז.
   5. תכנת את פרמטרי ההזרקה עבור CED.
      1. עבור נפח הזרקה של 5 μL, השתמש בשלבים הבאים: 1 μL ב- 0.2 μL / min, לאחר מכן 2 μL ב- 0.5 μL / min ו- 2 μL ב- 0.8 μL / min. התאם את נפח ההזרקה הסופי בהתאם לתוכנית הניסוי הספציפית על ידי שינוי פרופורציונלי של משך כל אחד מהשלבים.
      2. כדי להזריק את התמיסה לתוך murine caudate putamen (סטריאטום), בצע הזרקה כזו במצב 1 מ"מ קדמי ו 1.5-2 מ"מ לרוחב מ bregma בעומק של 3.5 מ"מ.
      3. לאחר ההזרקה, יש להשאיר את הצנתר במקומו למשך 2 דקות ולאחר מכן לסגת במהירות של 1 מ"מ/דקה כדי להבטיח פיזור נוזלים תקין במוח ולאטום את דרכי ההזרקה במהלך הוצאת הצנתר.
         הערה: ניתן לתכנת את כל הפרמטרים לסקריפט יחיד בהתאם לרובוט הסטריאוטקטי הספציפי.
   6. התחל את הליך CED והזריק 5 μL של תמיסה כחולה טריפאן לתוך בלוק agarose.
   7. העריכו את צורתו של ענן כחול טריפאן באגרוז ואת פוטנציאל הדליפה לאורך מערכת הצנתר. כחול טריפאן צריך ליצור אליפסואיד או ענן עגול עם המרכז סביב קצה הצנתר וקוטר של לפחות 1 מ"מ. אין לראות זרימה אחורית משמעותית מעל קצה מחט המתכת
   .
   8. מניחים בלוק אגרוז חדש ומתחילים זריקה שנייה של 1 μL ב 0.2 μL / min כדי להעריך את סתימת הצנתר עם האגרוז. כחול טריפאן אמור להתחיל שוב ליצור ענן מקצה הצנתר מיד לאחר תחילת ההזרקה.
   9. להעריך אם נפח שאריות מזרק מתאים 3 μL. כל וריאציה עשויה להצביע על דליפת נוזלים דרך הרכבה של הצנתר או בוכנה מזרק.
   10. אם כל זריקות הבדיקה מצליחות, הצנתר אטום היטב וישר, ולא נצפתה תמיסה כחולה טריפאן ממקומות אחרים מלבד קצה הצנתר, שטפו את הצנתר עם H₂O שעבר דה-יוניזציה (dH₂O) עד שלא נראים עקבות של טריפאן כחול ואז שטפו עשר פעמים באופן הבא: 70% אתנול ו-100% אתנול ולאחר מכן שטפו שוב עם 70% אתנול ומים נקיים שעברו דה-יוניזציה.
   11. יש לאחסן את הצנתר בתנאי יובש.

2. העברה משופרת של תמיסת נוגדנים למוח מורין

הערה: בהתאם לתקנות רווחת בעלי החיים המקומיות, ניתן ליישם סוגים שונים של חומרי הרדמה, משככי כאבים ואנטיביוטיקה עבור הליך זה. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בהרדמה בהזרקה. ניתן להשתמש בחומרי הרדמה אינהלציה כגון איזופלורן גם על ידי הרכבת מסכת אף על המסגרת הסטריאוטקטית. בנוסף, מומלץ להוסיף אנטיביוטיקה למי השתייה למניעת זיהומים.

1. מערך כירורגי
   1. הכינו חומרי הרדמה ותמיסות נוגדות. ניתן להרדים עכברים בבטחה באמצעות הרדמה בת שלושה רכיבים המכילה פנטניל (0.05 מ"ג/ק"ג), מידזולאם (5 מ"ג/ק"ג) ומדטומידין (0.5 מ"ג/ק"ג) מדוללים במים מזוקקים סטריליים (dH₂O). אנו מבצעים הליך התעוררות דו-שלבי באמצעות שתי תמיסות נוגדות, האחת מכילה פלומאזניל (0.5 מ"ג/ק"ג) ובופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג) ב-dH₂O סטרילי (תמיסת נוגדן ראשונה). השני יש atipamezole (2.5 מ"ג / ק"ג) ב dH_{סטרילי 2}O (תמיסת נוגדן שנייה).
   2. הכינו תמיסת שיכוך כאבים המכילה קרפרופן (5.667 מ"ג/ק"ג) מדולל ב-dH_{סטרילי 2}O.
   3. נקו את המסגרת הסטריאוטקטית, כרית החימום והאלמנטים של הרובוט הסטריאוטקטי. יש לזכור כי לא ניתן לנקות את כל חלקי הרובוט ללא סיכון לנזק. עיין במדריך הרובוט לקבלת פרטים על ניקוי והכנה לשימוש.
   4. הרכיבו את המזרק עם צנתר הצעד ושטפו אותו מספר פעמים עם dH₂O, 70% אתנול ו-100% אתנול, ולאחר מכן שטפו שוב עם 70% אתנול ו-dH₂O. לבסוף, שטפו את המזרק עם PBS או מאגרים אחרים כדי להכין את הפתרון להזרקה תוך גולגולתית, למשל, נוזל מוחי מלאכותי שדרתי. בוכנה מזרק צריך לנוע בצורה חלקה וחופשית במהלך ההליך.
   5. כייל את תוכנת הרובוט הסטריאוטקטי עם המסגרת הסטריאוטקטית.
   6. בדוק את תוכנת הרובוט הסטריאוטקטי על ידי כך שתוודא שזרועות הרובוט נעות בחופשיות, שמשאבת ההזרקה מחוברת כראוי, ושהיא יכולה לבצע את הליך CED ללא הפרעות. זה כולל בדיקת תנועת הרובוט, הזרקת השתוללות, בדיקת שלב ההמתנה של 2 דקות ובדיקת מהירות שליפת הצנתר. כל הפרמטרים צריכים להתאים להליך CED מתוכנת מראש המתואר בנקודה 1.3.5.
   7. הכנס את המקדחה למקדחה. מומלץ לעקר את המקדחה לפני השימוש.
   8. הכן תמיסת נוגדנים באמצעות PBS או תמיסות חיץ אחרות כגון נוזל מוחי מלאכותי (aCSF). 1 עד 20 מיקרוגרם של נוגדנים ב 5 μL ניתן להזריק בהליך CED אחד. נפחים אחרים וכמויות חלבון יש לבדוק לפני ביצוע הניסוי. שימו לב ששימוש בתמיסות בעלות צמיגות גבוהה עלול להוביל לסתימת קטטר.
   9. טען ידנית את המזרק עם הנוגדן המדולל.
2. הזרקת נוגדנים על ידי CED לתוך הסטריאטום
   1. שקלו את העכבר והזריקו את תמיסת ההרדמה בת שלושת המרכיבים לתוך הצפק בהתאם למשקל הגוף. שימו לב לזמן ההזרקה. העבירו את העכבר לכלוב נפרד המחומם באמצעות כרית חימום.
   2. התבונן בעכבר כדי לקבוע מתי מתחילה ההרגעה. כאשר העכבר מפסיק לנוע, יש למרוח משחה אופתלמית על העיניים כדי להגן על הקרנית מפני התייבשות במהלך הניתוח. טשטוש מלא מתחיל בדרך כלל 10-15 דקות לאחר הזרקת תמיסת ההרדמה בת שלושת הרכיבים.
   3. בדוק תגובות כאב באמצעות מבחן רפלקס צביטה כדי להבטיח הרדמה מלאה של החיה.
   4. יש לגלח את הראש באמצעות גוזם שיער.
   5. יש לחטא את העור במקלוני צמר גפן ספוגים בתמיסת יוד. יש לשפשף את העור שלוש פעמים בתנועה סיבובית.
   6. בצע חתך עור של 10 מ"מ לאורך קו האמצע של הגולגולת, וסיים בגובה העיניים באמצעות אזמל.
   7. תקן את העכבר במסגרת הסטריאוטקטית באמצעות מהדק האף ומוטות האוזניים. ודא שפני הגולגולת אופקיים ומאובטחים היטב. מלבד ניווט אנטומי נכון, חשוב גם להימנע מהטיה של הגולגולת במהלך הקידוח והליך CED.
   8. מניחים את המזרק ברובוט הסטריאוטקטי.
   9. סנכרן את מקדח המקדח עם קצה הצנתר בנקודת התייחסות. היחס בין מיקום המקדחה לבין המזרק חייב להיקבע במדויק בתוכנה כך שניתן יהיה לבצע את ההזרקה באזור האנטומי הרצוי במוח.
   10. הסירו את העור בעזרת מלקחיים ומיקמו את הברגמה על פני הגולגולת.
   11. הפניה Bregma בתוכנה באמצעות קצה מקדחה.
   12. הזיזו את המקדחה למצב 1 מ"מ קדמי ו-2 מ"מ רוחבי מברגמה וקדחו חור בור. היזהר לא לפגוע dura mater.
   13. העבר את המזרק מעל חור הבור.
   14. יש להוציא 0.5-1 μL מהמזרק כדי לוודא שלא נותרות בועות אוויר בצנתר.
   15. הפעל את תוכנית CED המתוארת בנקודה 1.3.5. התבונן בפני הגולגולת עבור עקבות של זרימת נוזל בחזרה מנקודת ההזרקה. עקוב אחר קצב הנשימה של החיה.
   16. לאחר סיום תוכנית ה-CED והוצאת הצנתר מהמוח, יש להפעיל את משאבת ההזרקה ב-0.2 מיקרוליטר/דקה כדי לבדוק אם הצנתר נסתם במהלך ה-CED. אם לא אירעה סתימה, אתה אמור לראות מיד טיפה של תערובת הזרקה מקצה הצנתר.
   17. לפני שימוש חוזר או אחסון של הצנתר, יש לבחון ויזואלית את שלב הצנתר תחת מיקרוסקופ לאיתור סימני נזק או בלאי ולנקות אותו כמו בשלב 1.3.10.

איור 1: שרטוט סכמטי המתאר את אזור היישום של הדבק. 10 המ"מ העליונים של צינור הסיליקה המאוחה מוחדרים למחט המתכת. החל את הדבק על צינור 10 מ"מ החל מקצה מחט המתכת.