בדיקה מבוססת תאים להערכת ספיגת חלבון טאו על ידי מיקרוגליה

תקציר

מקור: De Marco, D. et al., Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia.J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מציג בדיקה מבוססת תאים המכמתת את ספיגת טאו על ידי מיקרוגליה מורין באמצעות אגרגטים טאו רגישים ל-pH המסומנים בפלואורסצנטיים, המנותחים באמצעות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות לצורך הערכה כמותית.

פרוטוקול

1. תרבית תאי מיקרוגליה BV-2

הערה: טפל בתאי BV-2 תחת הכלה של בטיחות ביולוגית ברמה 2. קו התאים BV-2 מייצר רטרו-וירוס אקוטרופי רקומביננטי עטוף (המסוגל להדביק תאי מורין בלבד); וירוסים כאלה ידועים ביכולת הטרנספורמציה החוץ-גופית שלהם ובפוטנציאל הגידול שלהם in vivo.

1. תרבית BV-2 תאים בגלוקוז גבוה מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS), 100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין ו 2 mM L-גלוטמין (המכונה מדיום תרבית מעתה והלאה) על ידי זריעת תאים ב 4 x 10⁴ תאים / מ"ל.
2. שמור על תרבויות באווירה לחה של 5% CO₂ ב 37 ° C.
   הערה: התאים גדלים מחוברים באופן רופף ובתרחיף.

2. תייגו צברי טאו רקומביננטיים בצבע פלואורסצנטי רגיש ל-pH

הערה: אגרגטים של טאו הוכנו כמתואר ב-Apetri et al.עם ההבדל שלא נוסף תיאופלבין T (ThT) למאגר התגובה. דגימות מצטברות נאספו בצינורות צנטריפוגות של 1.5 מ"ל. האות הפלואורסצנטי הסופי נבדק על ידי ערבוב 118 μL של דגימת הבריכה עם 12 μL של תמיסת ThT של 50 מיקרומטר. האגרגטים הופרדו על ידי צנטריפוגה של תערובת תגובת הצבירה ב 20,000 x גרם במשך 1 שעה ב 4 ° C. הסופרנאטנט נותח על ידי SEC-MALS כדי לאשר שכל הטאו המונומרי הומר לצברים. כדוריות (אגרגטים של טאו) הוקפאו בהצמדה ואוחסנו במקפיא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

1. להשהות טאו אגרגטים ב 0.1 M סודיום ביקרבונט חיץ (NaHCO₃) ב pH 8.5 לריכוז של 1 מ"ג / מ"ל (~ 20 μM).
   הערה: ריכוז צברי הטאו מבוסס על ריכוז המונומרים הראשוני כפי שהוערך על ידי קליטת מונומרים טאו ב 280 ננומטר באמצעות מקדם הכחדה של 0.31 ^{mLmg-1 cm-1}
.
2. סוניק את האגרגטים המרחפים מחדש באמצעות סוניק בדיקה תוך שמירה עליהם על קרח כדי למנוע התחממות יתר.
   1. השתמש באמפליטודה של 65% (עם סוניק של כוח 250 W).
   2. בצע 8 פולסים של 3 שניות עם הפסקות של 15 שניות בין פולסים כדי למנוע התחממות יתר.
3. הכינו תמיסת מלאי של 8.9 מילימטר של צבע רגיש ל-pH (מעתה ייקרא צבע pH) בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) בהתאם להוראות היצרן.
   הערה: תמיד להכין פתרון טרי ולהשתמש בו רק ביום שהוא מוכן.
4. הוסף 10 שומות צבע לכל שומה של חלבון לריכוז צבע סופי של 0.2 mM.
5. מערבבים בעדינות למעלה ולמטה.
6. יש לדגור על תערובת התגובה במשך 45-60 דקות בטמפרטורת החדר, כשהיא מוגנת מפני אור.
7. בינתיים, הרכיבו עמודת התפלה צולבת של דקסטרן ג'ל בהתאם להוראות היצרן.
8. אזן את העמודה עם 25 מ"ל של 0.1 M NaHCO₃ pH 8.5 מאגר המכיל 3% DMSO. השליכו את הזרימה.
9. הוסף את המכפלה של תגובת התיוג המצרפית של טאו לעמודה בנפח כולל של 2.5 מ"ל. אם הדגימה קטנה מ- 2.5 מ"ל, הוסף מאגר עד לקבלת נפח כולל של 2.5 מ"ל.
10. תן את הדגימה להיכנס ג'ל ארוז לחלוטין, להשליך את הזרימה.
11. Elute עם 3.5 מ"ל של 0.1 M NaHCO₃ חיץ pH 8.5 המכיל 3% DMSO ולאסוף את eluate ב 4 שברים שווי ערך ב 2 מ"ל צינורות.
12. קבע את ריכוזי החלבון של 4 השברים על ידי בדיקת חומצה ביכומונית (BCA).
13. אחסנו את החלבון המסומן במקפיא בטמפרטורה של -20°C.

3. בדיקת ספיגה עם מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) קריאה

1. יום 1 – זרעו את התאים
   1. שטפו תאי BV-2 בבקבוק על ידי הסרת מדיום תרבית והוספת 1x מלח חוצץ פוספט (PBS).
      הערה: נפח הכביסה ישתנה בהתאם לגודל בקבוק התא בו נעשה שימוש. לדוגמה, עבור בקבוק T175, לשטוף עם 10 מ"ל של 1x PBS.
   2. הסר PBS מהבקבוק ונתק תאים על ידי דגירה עם חומצה טריפסין-אתילאנדיאמין טטראצטי (EDTA) 0.05% ב 37 ° C ו 5% CO₂ עד שהתאים להתנתק מן הבקבוק (כ 5 דקות).
      הערה: נפח של טריפסין-EDTA 0.05% תלוי בגודל של בקבוק התא בשימוש. לדוגמה, עבור צלוחיות T175, השתמש 2 מ"ל של טריפסין-EDTA 0.05%.
   3. להשהות מחדש תאים בתווך תרבית על ידי צנרת למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים.
      הערה: נפח מדיום הגידול משתנה בהתאם לגודל בקבוק התא המשמש ולכן המספר הכולל של התאים בצלוחית. לדוגמה, עבור בקבוק T175, השתמש 8 מ"ל של מדיום תרבית.
   4. לספור תאים וליצור תרחיף תאים עם ריכוז סופי של 1 x 10⁵ תאים/מ"ל בתווך תרבית המכיל 200 מיקרוגרם / מ"ל הפרין.
   5. צלחת 250 μL של תרחיף תאים (2.5 x 10⁴ תאים) לכל באר בתרבית רקמה 96 באר צלחת תחתונה שטוחה.
   6. יש לדגור על הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂.
2. יום 1 – הכינו אימונוקומפלקסים
   1. הפשירו pH צבע-טאו על קרח.
   2. הכינו 65 μl לכל מצב של תמיסה של 500 ננומטר של צברי pH dye-tau בתווך נטול סרום (SFM) (DMEM עתיר גלוקוז בתוספת 100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין ו-200 מיקרוגרם/מ"ל הפרין).
   3. הכינו דילול נוגדנים ב-65 μl של SFM בריכוז כפול מהגמר. ערבבו אגרגטים ונוגדנים של pH dye-tau בצלחת U-bottom של 96 בארות. הנפח הסופי לכל מצב הוא כעת 130 μl, וריכוז מצרפי pH dye-tau הוא 250 ננומטר. אטמו את צלחת הדילול ודגרו למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C.
3. יום 2 – ספיגת אימונוקומפלקסים
   1. הסר את אמצעי הטיפוח מתאי BV-2. יש לשטוף תאים פעם אחת בטמפרטורת חדר של 100 מיקרוליטר 1x PBS.
   2. העברת 125 μL של immunocomplexes לתאים באמצעות פיפטה רב ערוצית. לדגור על התאים עם immunocomplexes במשך 2 שעות ב 37 ° C ו 5% CO₂.
   3. הסר את מדיום הדגירה מהתאים והשלך אותו. יש לשטוף תאים פעם אחת בטמפרטורת חדר של 100 מיקרוליטר 1x PBS.
   4. יש להסיר PBS אחד ולטפל בתאים עם טריפסין-EDTA 50 μL 0.25% למשך 20 דקות ב-37°C ו-5% CO_2.
   5. מוסיפים 200 μL של מדיום תרבית ומרחפים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים. מעבירים תאים לצלחת U-bottom בעלת 96 בארות. צלחת צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
   6. הניחו את הצלחת על קרח, הסירו את מדיום הרבייה ושטפו תאים פעמיים על ידי השעיית כדורי התא ב-150 מיקרוליטר קר כקרח 1x PBS. צלחת צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
   7. שים תאים על קרח, להסיר הוסיף 1x PBS ולשטוף אותם על ידי השעיית תאים כדוריות ב 150 μL חיץ FACS קר (1x PBS, 0.5% אלבומין בסרום בקר (BSA), 2 mM EDTA). צלחת צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
   8. שים תאים על קרח, הסר מאגר FACS נוסף והשהה מחדש תאים במאגר FACS קר של 200 μL.
   9. נתח דגימות באופן מיידי על-ידי FACS המקבל 2 x 10⁴ אירועים בשער התאים החיים (ראה שלב 4.1).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תאי BV-2	קולקציית קו תאי ICLC Interlab	ATL03001
מלח חוצץ פוספט (PBS) (1X)	גיבקו	10010-015
טריפסין-EDTA 0.05%	גיבקו	25300-054
DMEM 4.5 גרם/ד"ל גלוקוז	גיבקו	41966-029
סרום בקר עוברי	גיבקו	10091-148
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)	גיבקו	15140122
ל-גלוטמין 200mM	לונזה	17-605E
EasYFlask	אנונימי	156499 / 159910
pHrodo ירוק STP אסטר	לייף טכנולוגיות	P35369
סודיום ביקרבונט pH 8.5 100 mM
DMSO	סיגמא	D2650-100 מ"ל
עמודות PD10	GE שירותי בריאות	17-0851-01
ערכת בדיקת חלבון BCA	תרמו פישר סיינטיפיק	23225
צלחות תרבות מולטיוול של גריינר CELLSTAR	גריינר	665180
פלקון 96-באר Assay צלחות	בז	353910
הפארין	סיגמא	H3393-50KU
טריפסין-EDTA 0.25%	סיגמא	T4049-100 מ"ל
BSA	סיגמא	A7030-100G
EDTA 0.5M, pH8