טכניקה לטיהור נוגדנים חד שבטיים המיוצרים על ידי תאי שחלה של אוגר סיני

תקציר

מקור: Velugula-Yellela, S. R., et al. טיהור וניתוח נוגדן חד שבטי מתאי שחלה של אוגר סיני באמצעות מערכת מיקרו-ביוריאקטור אוטומטית. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים בדיקה לטיהור נוגדנים חד-שבטיים מנוזל תרבית תאים שנאסף מתאי שחלות אוגר סיניות. הוא משתמש בשרף זכוכית נקבובי עם חלבון A משותק, שנקשר לאזור Fc של הנוגדנים בדגימה, ומפריד אותם ביעילות ממזהמים. השימוש במאגר אלוציה בעל pH נמוך מחליש את האינטראקציה, ומקל על שליפת נוגדנים מטוהרים.

פרוטוקול

1. טיהור נוגדנים

הערה: מאגר שיווי המשקל של נוגדן הבית הוא 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.5. חיץ האלוציה המשמש הוא 0.1 M חומצה אצטית. המאגרים והשרף (חלבון A) תלויים בנוגדן הספציפי שטוהר. נפח העמוד שווה לגובה המיטה של השרף. כמות השלב הנייד בשימוש נקבעת במונחים של נפח עמודה.

1. אתחול מערכת הטיהור
   1. פתח את התוכנה המצורפת למערכת הטיהור. באמצעות הוראות ידניות, אזנו את העמודה עם מאגר שיווי המשקל בקצב זרימה של 2 מ"ל/דקה למשך 40 דקות. הפסק את ההפעלה הידנית לאחר שיווי משקל.
   2. באספן השברים, הניחו 15 מ"ל צינורות חרוטיים כדי לאסוף נוגדנים מטוהרים וצינורות חרוטיים של 50 מ"ל כדי לאסוף זרימה במהלך שטיפת מלח גבוהה. ודא שאספן השברים מאופס למצב ההתחלה על-ידי פתיחה וסגירה של אוסף השברים לפני תחילת ההפעלה. אספן השברים נשמר ב 7 ° C.
      הערה: ניתן לאפס את אספן השברים באופן ידני תחת הכרטיסיה אספן שברים בהגדרות, הן עבור צינורות של 15 מ"ל והן עבור צינורות של 50 מ"ל.
2. הזרקת דוגמה
   הערה: נוזל תרבית התאים שנקצר המשמש בהליכים הבאים התקבל מתאי שחלה של אוגר סיני שגודלו בתרבית במיקרו-ביוריאקטורים אוטומטיים.
   1. הוסף את נוזל תרבית תאי הקציר המסונן 0.22 מיקרומטר למזרק ריק של 12 מ"ל שקצה הזרבובית שלו מכוסה.
   2. מחזיק את המזרק עם הזרבובית פונה כלפי מטה, להכניס את הבוכנה מזרק עד חלק קטן של הבוכנה הוא פנימה. מוודאים שהנוזל אינו דולף, סובבו את המזרק כשהזרבובית פונה כלפי מעלה והסירו את הפקק.
   3. עדיין מחזיקים את המזרק כשהזרבובית פונה כלפי מעלה, דוחפים את הגליל כדי לפזר את האוויר עד שנוזל תרבית התאים נמצא בקצה הזרבובית. הכנס את פיית המזרק ליציאת ההזרקה הידנית במערכת הטיהור וסובב כדי להדק.
   4. לחץ כלפי מטה על הבוכנה עד שכל הדגימה מוזרקת ונראית בלולאת הדגימה המצורפת בנפח גדול של 10 מ"ל
   .
   5. פתח את קובץ השיטה שנשמר. שמור את קובץ התוצאות במיקום הנדרש וציין את שם הקובץ כשתתבקש. לחץ על Run לאחר הזרקת הדגימה ללולאת הדגימה בנפח גדול.
3. הפעלת שיטת הטיהור
   1. בחר את השיטה השמורה ולחץ על הפעל כאשר תתבקש על-ידי תוכנת המכשיר (שלב 1.2.5).
      הערה: המערכת מוגדרת להפעיל את השלבים הבאים. המשתמש לא צריך לעשות שום דבר בזמן שהמכשיר פועל.
   2. אזן את העמודה עם שלושה נפחי עמודות (CV) של מאגר שיווי משקל בקצב זרימה של 2 מ"ל/דקה. לאחר איזון העמודה, המערכת, באמצעות לולאת הדגימה בנפח גדול, תזריק את הדגימה לעמודה בקצב זרימה של 1 מ"ל/דקה.
   3. ירידה באות UV ב 280 ננומטר מציין כי הדגימה הסתיימה לטעון. שטוף את העמוד עם מאגר שיווי משקל בקצב זרימה של 2 מ"ל/דקה עד שאות ה-UV יורד מתחת ל-25 mAU.
   4. השתמש בארבעה קורות חיים של 25 mM Tris עם 1 M NaCl ב- pH 7.5 כדי לבצע שטיפת מלח גבוהה משנית בקצב זרימה של 2 מ"ל לדקה. קולט חלקי המערכת יאסוף כל חלבון/דנ"א שיורד מהעמוד במהלך שטיפת המלח בצינורות של 50 מ"ל.
   5. יש למרוח חמישה קורות חיים של חיץ אלוציה בקצב זרימה של 1 מ"ל/דקה כדי להוציא את הנוגדן מהעמודה. לאסוף את eluate בצינורות 15 מ"ל מבוסס על אות UV; כאשר אות UV 280 הוא מעל 35 mAU, איסוף מתחיל; האיסוף מסתיים כאשר האות יורד מתחת ל -50 mAU; זה נקרא Peak Cutting.
      הערה: חיתוך שיא מבטיח נורמליזציה של פרופילי אלוציה וכדי למנוע זנב שיא אלוציה שעשוי להכיל אגרגטים חלבוניים.
   6. שטוף את העמודה באמצעות שלושה קורות חיים של מאגר שיווי משקל. הריצה מסתיימת לאחר שלב השטיפה.
   7. לאחר ההדחה יש לנטרל מיד את החלבון המטוהר באמצעות בסיס טריס M 1 לרמת חומציות של ~5.5. מדוד את ריכוז החלבון באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis מיקרו-נפח ב- 280 ננומטר ו- 260 ננומטר ואחסן ב- 4 ° C.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קו תאים CHO DG44	Invitrogen	A1100001
אקטה אוונט 25	ג'נרל אלקטריק מדעי החיים	28930842
Pro Sep vA Ultra Chromatography Resin	מיליפור סיגמא	115115830	שלב טיהור נייח
עמוד אומניפיט 10 ס"מ	Diba אינטליגנציה נוזלית	006EZ-06-10-AA	דיור לשלב נייח
בסיס טריס	פישר סיינטיפיק	BP154-1
סופרלופ 10 מ"ל	GE שירותי בריאות	18-1113-81
μDawn גלאי פיזור אור רב זוויתי	וויאט	וושחר-01
0.22 מיקרומטר יחידת מסנן Millex GV קרום PVDF	מרק מיליפור	SLGV033RB
10X פוספט מלח חוצץ	קורנינג	46-013-ס"מ
12 מ"ל מזרק	קובידיאן	8881512878
50 מ"ל צינור פלקון	קורנינג בע"מ	352070
צלחת 96 בארות	ביו-ראד	127737
חומצה אצטית	סיגמא-אולדריץ'	695072
Amicon Ultra-4 100 kDa מסננים צנטריפוגליים	מרק מיליפור	UFC810096
חומצות אמינו, 1nmol/μL	אג'ילנט טכנולוגיות	5061-3330
תוסף חומצות אמינו	אג'ילנט טכנולוגיות	5062-2478
תמיסת אמוניום פורמט - אנליזת גליקן	תאגיד ווטרס	186007081
מכסי בורג כחולים עם Septa	אג'ילנט טכנולוגיות	5182-0717
כרומטוגרפיה מים (כיתה MS)	פישר כימיקלים	W6-4
חומצה הידרוכלורית	פישר סיינטיפיק	A144-500
תקן בדיקת מסה mAb תקין	תאגיד ווטרס	186006552
עמוד חומצת אמינו אינטרדה 150 x 2 מ"מ	Imtakt	WAA25
ספקטרופוטומטר UV-Vis מיקרו-נפח אחד	תרמו פישר סיינטיפיק	840274100

תקן