כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
PART 1: הקמת תרביות נוירונים מנותקות, עובריות, מכרסמים בהיפוקמפוס
1. שלבי הכנה
- ציפוי פולי-L-ליזין (PLL) של משטחי הציפוי (3 ימים לפני נתיחה)
- הכינו את חיץ הבוראט על ידי הוספת 2.38 גרם חומצה בורית ו-1.27 גרם בורקס ל-500 מ"ל מים מזוקקים וערבוב במשך 15 דקות עד להמסה. מתחת למכסה המנוע, יש לעקר את תמיסת החיץ על ידי סינון (גודל נקבוביות של 0.2 מיקרומטר), לתייג ולאחסן בטמפרטורת החדר (RT).
הערה: פתרון זה יציב וניתן להשתמש בו למשך 6 חודשים.
אזהרה: בעת הכנת חיץ בוראט, יש ללבוש ציוד מגן אישי מומלץ.
- הכינו את תמיסת ציר PLL (100 מ"ג/מ"ל) על ידי הוספת גרם אחד של PLL ל-10 מ"ל מים מזוקקים וערבוב עד להמסה. הכן 500 μL aliquots של תמיסת מלאי PLL. כדי להגיע לריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל, יש להוסיף 500 μL של PLL aliquot ל-50 מ"ל של חיץ בוראט ולהסתחרר עד להמסה, ולעקר את התמיסה על ידי סינון (0.2 מיקרומטר גודל נקבוביות).
הערה: פתרון זה יציב וניתן להשתמש בו במשך 6 חודשים.
- מכינים את המשטחים לציפוי. השתמשו בכיסויים בקוטר 12 מ"מ להליכי צביעה חיסונית ובצלחות עם תחתית זכוכית למחקרים שיכללו הדמיה של נוירונים חיים. אם אתה משתמש בכיסויים, autoclave ולאחר מכן מניחים חמישה כיסויים בכל צלחת (קוטר 3.5 ס"מ).
הערה: עובי הכיסוי משפיע על איכות ועוצמת האות של התמונות שנרכשו. רוב מטרות המיקרוסקופ מיועדות לכיסויים #1.5. בחרו את הכיסויים המתאימים בהתאם למערך ההדמיה ולטכניקות.
- מתחת למכסה המנוע, מוסיפים 1.5 מ"ל של תמיסת PLL לכל מנה (צלחת עם תחתית זכוכית או צלחת 3.5 ס"מ עם חמישה כיסויים). ודא שכל הכיסויים שקועים ומאוחסנים ב- RT למשך 24 שעות.
- יומיים לפני הנתיחה, יש לשאוף את תמיסת PLL ולשטוף במים סטריליים נטולי אנדוטוקסין, תוך הקפדה על שקוע בכיסויים. יש לשמור מים בכלים ולאחסן ב-RT למשך 24 שעות.
- יום אחד לפני הנתיחה, שאפו את המים והחליפו אותם במדיה תרבותית NB + B27 (ראו להלן), והניחו את הכלים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
- הכנת פתרון תרבות, מדיה ומלאי (יום לפני נתיחה)
- מדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM): עד 500 מ"ל של DMEM גלוקוז גבוה (4.5 גרם / ליטר) ללא L-גלוטמין ופנול אדום, הוסף 50 מ"ל של סרום סוסים, 50 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS), 10 מ"ל של L-גלוטמין (200 מ"ל), 10 מ"ל של נתרן פירובט (100 מ"ל), 10 מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U / מ"ל). סנן (גודל נקבוביות 0.2 מיקרומטר) ואחסן ב 5 מ"ל aliquots ב 4 oC עם מכסה סגור היטב.
הערה: פתרון זה הוא יציב וניתן להשתמש בו במשך חודש 1.
- Neurobasal (NB) בינוני בתוספת B27 (NB + B27): כדי 50 מ"ל של NB בינוני ללא פנול אדום, להוסיף 1 מ"ל של תוספת B27.
- Hibernate-E medium בתוספת B27 (Hibernate + B27): ל-50 מ"ל של Hibernate-E medium, יש להוסיף 1 מ"ל של תוסף B27.
- תמיסה פיזיולוגית חוץ-תאית (EPS): ל-1 ליטר מים סטריליים, יש להוסיף את הדברים הבאים בריכוזים הסופיים שצוינו: NaCl (140 mM), KCl (3.5 mM), N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) (HEPES, 10 mMM), גלוקוז (20 mM) ו-CaCl2 (2 mM). יש לערבב עד להמסה ולהתאים את רמת החומציות ל-7.4 על-ידי הוספת NaOH (0.5 M) או HCl (0.5 M). מתחת למכסה המנוע, יש לעקר באמצעות סינון (גודל נקבוביות של 0.2 מיקרומטר) ולאחסן בטמפרטורה של 4°C.
- ציוד וחומרי מעבדה אחרים (יום הנתיחה)
- הגדר אמבט מים ל 37 מעלות צלזיוס. חממו את האליציטוטים הבאים: 50 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS), ו -5 מ"ל של DMEM.
- עקרו את הכלים הבאים על-ידי טבילה בכד המכיל אתנול מוחלט (איור 1B): מלקחיים, מלקחיים מעוקלים, מספריים, מלקחיים מעוקלים דקים, מלקחיים ישרים דקים, מספריים לניתוח, מלקחיים בזווית עדינה ומספריים קפיציים מדויקים.
הערה: כדי להגן על הכלים, הניחו חומר רך (למשל, מגבונים מדויקים מדעיים) בתחתית הכד.
- מלאו שני מגשים בקרח והניחו את הפריטים הבאים.
- מגש קרח 1 (איור 1C): הניחו בכלי ניתוח בכד עם אתנול מוחלט, עם HBSS לשטיפת כלי הניתוח, צלחת בגודל 10 ס"מ עם HBSS להנחת העוברים, צלחת בגודל 6 ס"מ עם HBSS להנחת ראשי העוברים, וצלחת בגודל 6 ס"מ עם תרדמת חורף + B27 להנחת מוחות העוברים.
- מגש קרח 2: מניחים 1 מ"ל aliquot של טריפסין 2.5% צלחת 3.5 ס"מ עם תרדמה + B27 עבור היפוקמפוס מנותח.
הערה: הזמן הדרוש להליך זה תלוי בניסיונו של החוקר ובמספר העוברים שיש לנתח. לכן, הקרח חייב להישאר קפוא למשך פרק הזמן הדרוש. מגשי פוליסטירן מומלצים למטרה זו.
2. נתיחה וזריעה (איור 1)
- בידוד היפוקמפוס
הערה: חולדות הרות עם עוברים ביום העוברי ה-18 (E18) עוברות המתת חסד מיד לפני תחילת הפרוטוקול בהתאם לוועדת האתיקה המקומית של אוניברסיטת ברצלונה, בהתאם לתקנות האירופיות (2010/63/UE) בנוגע לשימוש וטיפול בחיות ניסוי. בפרוטוקול זה, שאיפת פחמן דו חמצני (CO2) שימשה כשיטה להמתת חסד.
- לנתח את החולדה ברמה של הצפק הבטן באמצעות מלקחיים ומספריים. לחלץ את הרחם עם עוברי E18 ולהניח אותו בכלי 10 ס"מ כי כבר צונן על קרח.
הערה: חשוב להימנע משערות החולדה הנצמדות לעוברים. מומלץ להשתמש בכמויות גדולות של 70% אתנול כדי לעקר את הבטן. משלב זה ואילך, עבדו בתוך מכסה המנוע על מגש קרח 1.
- פתחו את השקים העובריים והעבירו את העוברים לצלחת בקוטר 10 ס"מ עם HBSS, תוך הקפדה על שקועים במלואם.
- מוציאים את ראש העובר עם מספריים ומניחים אותו בצלחת 6 ס"מ עם HBSS. חזור על תהליך זה עם כל העוברים.
הערה: כדי למנוע זיהום, יש להשליך את כל הרקמות, למעט ראשי העובר, במיכל עם מכסה בורג.
- החזק את ראש העובר במלקחיים מעוקלות עדינות ונקב את המסלולים עם זוג מלקחיים ישרים עדינים, נכנסים בזווית של 45 מעלות, ולאחר מכן שחרר את המלקחיים המעוקלים העדינים.
הערה: אסור שהמלקחיים יעברו דרך המוח, ולכן חשוב לשמור על הזווית כשנכנסים.
- לנתח את העור ואת הגולגולת עם מספריים הניתוח, החל מן העצם העורפית אל העצם הקדמית. הסר את המוח עם זוג מלקחיים מעוקלים דקים והנח אותו בצלחת 6 ס"מ עם תרדמה + B27. חזרו על התהליך הזה עד שכל המוחות יתאוששו.
- קשת להפריד את telencephalons עם מלקחיים ישר דק.
הערה: משלב זה ואילך, הדיסקציה של ההיפוקמפוס מתבצעת תחת סטריאומיקרוסקופ. מומלץ להשתמש במנורות מפרקיות כך שהאור יאיר את משטח הדיסקציה מהצדדים. מומלץ גם להשתמש ברקע שחור מכיוון שזה מספק ניגודיות רבה יותר, ומאפשר להבחין טוב יותר בין ההיפוקמפוס.
- הכינו צלחת של 10 ס"מ על ידי הנחת טיפות של תרדמת חורף + B27 במרחקים של 1 ס"מ (למשל, במעגל). הניחו טלנספלון אחד לכל טיפה של מצב שינה + B27 ודמיינו דרך טווח הניתוח (מומלץ להגדיל פי 1.25
).
- בזהירות לקלף את קרומי המוח ולהסיר את התלמוס כדי לדמיין טוב יותר את ההיפוקמפוס.
- נתחו את ההיפוקמפוס בעזרת מספריים קפיציים מדויקים והניחו אותו בצלחת בקוטר 3.5 ס"מ עם מצב שינה + B27 במגש קרח 2. חזור על כל telencephalon עד שכל ההיפוקמפוסים נאספים.
- בזהירות לאסוף את כל hippocampi עם פיפטה פסטר ולהעביר אותם 50 מ"ל צינור.
הערה: קח את נפח מינימלי של תרדמה + B27 בעת איסוף היפוקמפי כדי לא לדלל את טריפסין.
- דיסוציאציה של תאים
- דיסוציאציה אנזימטית של ההיפוקמפוס
- בצינור 50 מ"ל המכיל את ההיפוקמפי, להוסיף 1 מ"ל של 2.5% טריפסין ולהביא אותו לנפח 5 מ"ל עם HBSS. יש לדגור במשך 15 דקות באמבט המים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
- כדי לדלל את טריפסין, להוסיף 10 מ"ל של HBSS מחומם מראש לדגור במשך 5 דקות באמבט המים ב 37 °C (77 °F).
- מעבירים את ההיפוקמפוס שמופיע כעת כמסת ריר לצינור של 50 מ"ל עם מיקרופיפטה של 1,000 מיקרוליטר, מוסיפים 6 מ"ל של HBSS שחומם מראש, ודגרים במשך 5 דקות באמבט המים ב -37 מעלות צלזיוס.
- דיסוציאציה מכנית של ההיפוקמפוס
- מעבירים את המסה לצינור 2 מ"ל עם תחתית חרוטית, לוקחים את הנפח המינימלי. הוסף 1 מ"ל של מדיה DMEM שחומם מראש. הומוגניזציה של הגלולה עם מיקרופיפטה של 1,000 μL על ידי שאיפה עדינה למעלה ולמטה.
הערה: זה קריטי כדי למנוע יצירת בועות בעת שאיפה, כמו בועות עלול לשכב את התאים.
- חזור על השאיפה למעלה ולמטה עם פיפטת זכוכית משוכה מראש (10x-20x), כאשר קצהו בא במגע עם החלק התחתון החרוטי של הצינור. הימנעו מיצירת בועות. בסוף שלב זה, התערובת חייבת להיות שקופה.
- לאחר ערבוב הומוגני כך שהתערובת שקופה, מעבירים את התערובת לצינור המכיל 4 מ"ל של מדיה DMEM ב 37 ° C והומוגניזציה עם פיפטה זכוכית על ידי pipeting למעלה ולמטה.
- זריעת תאים
- ספור את התאים. ניתן לספור את מספר תאי העצב בתמיסה על פי נהלי מעבדה סטנדרטיים.
הערה: בניסויי הדמיה לגילוי נוגדנים ופעילות סידן, ריכוז של 50,000 תאים לצלחת של 3.5 ס"מ הוא אופטימלי.
- שומרים על התאים תלויים, מושכים את הנפח המחושב ולוחמים בצלחות בקוטר 3.5 ס"מ המכילות כיסויים מצופים PLL או בכלי תחתית זכוכית מצופים PLL.
- פזרו באופן שווה את התאים על הכלים על ידי ניעור רך בתנועות מוצלבות (קדימה ואחורה, ואז מצד לצד; חזרו על הפעולה לפי הצורך) והכניסו את הכלים לאינקובטור CO2 (5%) .
הערה: חשוב להשתמש בתנועות מוצלבות כדי למנוע מהתאים להתיישב בשולי המנה.
- בכל שבוע, להוסיף כ 1 מ"ל של NB + B27, כך התרבות לא יבש.
הערה: לאחר שבועיים (14 ימים במבחנה [div]), תאי העצב בשלים ומבטאים את כל הגורמים שישמשו לניסויים. המספר הממוצע הכולל של תאי עצב המתקבלים באמצעות פרוטוקול זה הוא כ 2.5 x 106 נוירונים המגיעים בממוצע של 12 עוברי E18 לכל חולדה בהריון.
PART 2: שימוש בתרביות נוירונים בהיפוקמפוס לזיהוי נוגדנים בחלבוני פני השטח של תאי העצב
הערה: חלק זה של הפרוטוקול מדגים כיצד תרביות היפוקמפוס משמשות לזיהוי נוגדנים נגד NMDAR בסרום ו/או CSF של חולים עם דלקת מוח נגד NMDAR. אימונוסטיין פלואורסצנטי משמש כדי לדמיין את התגובה בנוירונים החיים, אבל שיטות הדמיה אחרות יכול לשמש גם. בקרה מתאימה לניסוי זה תהיה סרום או CSF מאדם בריא. בעת שימוש בדגימות אנושיות, יש לזכור כי ייתכן שיהיה צורך באישור הוועדה האתית המוסדית.
3. אימונוסטיישן פלואורסצנטי חי
- השתמש ב-14 תאי div שגדלו על גבי כיסויים (50,000 תאים לצלחת בגודל 3.5 ס"מ המכילה חמישה כיסויים).
- בתוך מכסה המנוע, שטפו את הכיסויים עם NB שחומם מראש ל-37°C.
- הוסף את הדגימה שבמקרה זה מכילה נוגדנים נגד NMDAR (המשמשים כנוגדן ראשוני) מדוללים במדיה NB בשעה 1:200 עבור סרום או 1:2 עבור CSF ודגור 1 שעות ב 37 ° C (בתוך אינקובטור CO2 (5%).
- יש לשטוף בזהירות במי מלח חוצצי פוספט (PBS) 3x ב-RT.
- מוסיפים תמיסת קיבוע (4% פורמלדהיד ב-PBS) ודגרים ב-RT למשך 5 דקות
זהירות: בעת טיפול ב-4% פורמלדהיד, יש לעבוד בתוך מכסה המנוע וללבוש ציוד מגן אישי מומלץ.
- יש לשטוף 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד.
- הוסף נוגדן משני עז אנטי אנושי AF488 בדילול 1:1000 ודגרה ב- RT למשך 1 שעות
הערה: במהלך הדגירה, יש להגן מפני חשיפה לאור על ידי כיסוי ברדיד אלומיניום.
- יש לשטוף 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד. יש לשטוף במים מזוקקים
- הרכיבו את הכיסויים עם אמצעי הרכבה נוזלי (למשל, אמצעי הרכבה נגד דהייה עם DAPI; כ-7 מיקרוליטר), שאפו את שאריות הנוזל ושטפו במים מזוקקים. תאי העצב מוכנים כעת לדימות פלואורסצנטי.
זהירות: בעת הטיפול באמצעי הרכבה, לבש את ציוד המגן האישי המומלץ.
