כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
הערה: יש לבצע את כל השלבים במכסה מנוע BSL2 אלא אם צוין אחרת. טיטרציה ויראלית נדרשת לפני בדיקת נטרול הפחתת פלאק (PRN) כדי לקבוע את ריכוז ה- RSV האופטימלי המשמש בבדיקת PRN. מומלץ להעלות את מלאי הנגיף בנפח קטן שיפשיר פעם אחת וישמש לכל בדיקת NAb. מומלץ גם להשתמש באותו מלאי ויראלי עבור כל בדיקות NAb שבוצעו עבור כל הדגימות ממחקר אחד. ודא שמדיה תרבית ותמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) מחוממים ב -37 מעלות צלזיוס לפני הוספתם ללוחות התא.
1. טיטרציה ויראלית RSV
הערה: בהתאם למספר מלאי הווירוסים ומספר הכפילויות, ניתן להגדיר את לוחית הבדיקה לפי איור 1. כל מלאי וירוסים צריך להיות טיטרציה משולשת במורד צלחת הבדיקה, החל מהריכוז הנגיפי הגבוה ביותר (כלומר, 1:10). טיטרציות טוריות יכולות להיות בדרך כלל ביחס של 1:10. תרבית תאים A549 ותחזוקתה ונהלי תרבית RSV נעשים באמצעות הליכים סטנדרטיים ואינם כלולים בפרוטוקול זה.
- צלחות זריעה (יום 1)
- השהה מחדש תאי A549 במדיום הנשרים המהונדסים של דולבקו (DMEM) + 10% סרום עגל עוברי (FCS) + 1000 IU פניצילין/סטרפטומיצין (עט/סטרפ) ב 4 x 105/מ"ל. זרע 96-באר שטוח-תחתית סטרילית לוחות עם 100 μL / באר המכילים 4 x 104 A459 תאים.
- לדגור על צלחות לילה ב 37 ° C, 5% פחמן דו חמצני (CO2) (תאים יהיו בשלב הצמיחה log).
הערה: השתמש בבקבוקון תא A549 חדש לאחר 23 מעברים. מומלץ לא להתחיל את הניסויים כאשר בקבוקון תא חדש עדיין נמצא בשלושת המעברים הראשונים.
- זיהום וירוס (יום 2)
- הכנת דילול סדרתי של וירוסים
- הפשירו במהירות בקבוקון קפוא יחיד של נגיף סינסיטיאלי נשימתי (RSV) באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עד להפשרה כמעט מוחלטת והניחו מיד על קרח. הכינו 3 עותקים משוכפלים עבור כל מלאי וירוס RSV לבדיקה, השתמשו בדילול מלאי וירוסים ראשוני של 1:10 עם 100 מיקרוליטר של וירוס/באר מדוללים, ושמרו לפחות עמודה אחת לבקרה שלילית.
הערה: איור 1 מראה שליטה שלילית בטריפליקטים.
- הוסף 100 μL של כל וירוס מדולל ב 1:10 במשולש של שורה A של צלחת סטרילית 96 באר U-תחתית. הוסף 90 μL / באר של DMEM + 1000 IU עט / strep ללא FCS לשורות B עד H.
- בצע דילול טורי של 1:10 במורד הצלחת על ידי העברת 10 μL משורה A לשורה B. ערבב את התמיסה על ידי פיפטת תוכן למעלה ולמטה 5 פעמים והמשך את הדילולים פי עשרה עד שורה H. השליכו את 10 μL הסופיים כך שהנפח הסופי בכל באר יהיה 90 μL.
הערה: חשוב להשתמש בטיפים חדשים עבור כל דילול.
- חיסון וירוסים לתאי A549
- אחזר לוחות תא A549 שהוכנו ביום הקודם. ודא כי מונושכבות תאים A549 בלוחות 96 באר הם ~ 80% חופפים. יש להשליך את המדיה על ידי היפוך עדין של הצלחת והכתמה קלה על מגבת נייר סטרילית סופגת.
- שטפו את כל הבארות עם 100 מיקרוליטר של PBS פעמיים; השליכו את עודפי PBS על ידי היפוך עדין של הצלחת וכתמים קלים על מגבת נייר סטרילית סופגת לאחר כל כביסה. אין לאפשר לצלחות להתייבש.
- העבירו את דילולי הנגיף מלוח הטיטרציה הנגיפי (איור 1) לבארות תואמות על לוח התאים A549. לדגור על הצלחת במשך 1 שעה ב 37 ° C, 5% CO2. לאחר דגירה של שעה, סופרנאטנטים דקאנטים באמצעות פיפטה (כדי למנוע זיהום צולב). מוציאים 90 מיקרוליטר/באר.
- הוסף 100 μL של 1x בינוני 199 (M199, ראה טבלת חומרים) + 1.5% carboxymethylcellulose נתרן מלח (CMC) צמיגות נמוכה + 2% FCS המכיל עט / strep לכל באר.
הערה: יש להכין ולאחסן שני פתרונות M199 + 4% FCS + 2% עט/סטרפטוקוקוס ו-3% CMC בטמפרטורה של 4°C לשימוש עתידי. ודא את הפתרון מחומם ב 37 ° C לפני הוספה לצלחות.
- הכן 2x פתרון M199: 1 שקיק / 500 מ"ל מים מזוקקים + 20 מ"ל FCS + 10 מ"ל עט / strep (כדי להשלים 2x MI99). סנן את התמיסה באמצעות יחידת מסנן של 0.22 מיקרומטר.
- להכנת 3% CMC, להוסיף 15 גרם של CMC לאט לתוך 500 מ"ל של מים מזוקקים. ממיסים את ה-CMC במים באמצעות מחמם מערבל מתכתי בטמפרטורה של 50°C, שלוקח בערך שעה להכין. מערבבים היטב כדי להפוך 3% CMC autoclave את הפתרון.
הערה: יש להוסיף את מוצק CMC למים כדי להתמוסס; הוספת מים למוצק היבש יוצרת "גוש" של מוצק שקשה מאוד להמיס.
- הכן 1x M199 + 1.5% CMC צמיגות נמוכה + 2% FCS המכיל עט / סטרפ על ידי ערבוב 1: 1 2x M199 ו 3% CMC מוכן בשלב 1.2.2.4.2.
- דגירה צלחת במשך 3 ימים ב 37 ° C, 5% CO2.
- פיתוח צלחת בדיקה וניתוח (יום 5)
- קיבוע ופיתוח צלחת בדיקה
- יש להשליך M199 + CMC + 2% FCS המכיל עט/סטרפטוקוקוס על ידי היפוך עדין של הצלחת. הוסף לאט (כדי למנוע הפרעה לשכבת התא) 200 μL של מאגר קיבוע (80% אצטון, 20% PBS, מאוחסן ב -20 ° C) כדי לתקן תאים. יש לדגור בטמפרטורה של -20°C למשך 20 דקות.
- יש להשליך את מאגר הקיבוע ולמרוח אותו בעדינות על מגבת נייר סופגת. השאירו את הצלחת עם הפנים לייבוש למשך 10 דקות. < בר/>
הערה: משלב זה ואילך, ניתן לבצע את הבדיקה מחוץ למכסה המנוע BSL2.
- הכינו תמיסת חסימת מדלל חלב 5% ב-PBS מסונן המכיל 0.05% פוליסורבט-20 (PBS-פוליסורבט, ראו טבלת חומרים). חשב את הנפח הדרוש לחסימה עבור צלחת אחת בהתבסס על 200 /well ו- 110 בארות: 200 μL/well x 110 wells = 22 mL (1.1 מ"ל חלב מרוכז מדלל ב- PBS-polysorbate מסונן 20.9 מ"ל). בשלב זה, מהווים גם פתרון חסימה מספק לנוגדנים ראשוניים ומשניים. חשב את הנפח הדרוש לכל תמיסת נוגדנים עבור צלחת אחת בהתבסס על 50 μL / באר ו 110 בארות: 50 μL / באר x 110 בארות = 5.5 מ"ל. לכן, הנפח הכולל של תמיסת חסימת מדלל חלב הנדרשת לבדיקת צלחת אחת הוא 33 מ"ל.
- הוסף 200 μL / באר של פתרון חסימה. דוגרים על הצלחת בטמפרטורת החדר (RT) למשך 30 דקות. השליכו את התמיסה על ידי היפוך עדין של הצלחת והכתם על מגבת נייר סופגת.
- הכינו נוגדן 1:500 עז X RSV (mAb – נוגדן ראשוני) מדולל בתמיסת חסימה. הוסף 50 μL / באר של תמיסת mAb ודגור ב 37 ° C במשך 1 שעה. שטפו את הצלחת 3 פעמים עם PBS-פוליסורבט מסונן.
- הכינו 1:5,000 אלקסה-פלואור חמור נגד עז IgG (נוגדן משני) מדולל בתמיסת חסימה. הוסף 50 μL / באר של תמיסת נוגדנים משנית לדגור ב 37 ° C במשך 1 שעה. שטפו את הצלחת 5 פעמים עם PBS-פוליסורבט מסונן.
- קראו את הלוח בקורא ספוט אוטומטי באמצעות ערוץ פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) והגדרות ספירה, כפי שמוצג באיור 2. עטפו את הצלחת בנייר כסף ואחסנו אותה בטמפרטורה של 4°C. כיילו את המכשיר באמצעות לוח תרבית של 96 בארות שאינו בשימוש והגדרות ספירת קלט לפני assay.
הערה: סריקה חוזרת תוך מספר ימים אפשרית במידת הצורך. ניתן לשמור את הגדרת הכיול והספירה ולהשתמש בהם לסריקה עתידית אם הבדיקה משתמשת באותו סוג לוח המשמש לכיול.
- בדקו בתמונות של בארות אם יש לוחות חפציים או חד-שכבות של תאים משובשים (איור 3). לא לכלול בארות עם monolayers תאים משובשים.
הערה: בהתאם לגודל לוחות החפץ, ייתכן שיהיה צורך לבצע ספירות ידניות עבור בארות אלה, או שיהיה צורך להשליך בארות אלה מניתוח נתונים. הקריטריונים לתוצאה תקפה כוללים היעדר חד-שכבה של תאים משובשים או לוחות חפץ שזוהו ביותר מבאר משוכפלת אחת וללא יחידות יוצרות פלאק (PFU) שזוהו בבארות שליליות (בארות ללא תוספת וירוס).
- קביעת ריכוזי הנגיפים
- בחר את שני הדילולים האחרונים שבהם ניתן לספור כתמים בבירור. חשב את המספר הממוצע של כתמים מבארות משוכפלות באותו דילול. חשב את הטיטר הנגיפי (PFU למ"ל) של דגימת המניות באמצעות הנוסחה הבאה:
PFU/mL = מספר ממוצע של פלאקים/(גורם דילול × נפח הנגיף המדולל שנוסף לבאר)
הערה: ריכוז הנגיף שנקבע עבור כל מלאי RSV יכול כעת לשמש בבדיקת PRN (שלב 2).
2. בדיקת נטרול RSV
- צלחות זריעה (יום 1)
- השהה מחדש תאי A549 ב- DMEM + 10% FCS + 1000 IU עט/סטרפטוקוקוס ב- 4 x 105/mL. זרעו 96 צלחות סטריליות שטוחות עם תחתית שטוחה של 100 μL / באר המכילות 4 x 104 תאי A459 וצלחות דגירה לילה ב 37 ° C, 5% CO2 (תאים יהיו בשלב הצמיחה log).
הערה: השתמש בבקבוקון תא A549 חדש לאחר 23 מעברים. לא מומלץ להשתמש בתאי A549 לפני מעבר מספר 3.
- הכנת וירוסים וסרום (יום 2)
הערה: בהתאם לסוג המדגם, ישנם השלבים הדרושים לעיבוד מקדים של דגימות לפני בדיקת NAb. מומלץ להשתמש בתקן הבינלאומי RSV sera הזמין כעת על פי בקשה מהמכון הלאומי לתקנים ובקרות ביולוגיים (NIBSC).
- הכנת דילול סרום
- יש להפשיר את האנטי-סרום האנושי ל-RSV (סרום ייחוס, REF) ואת דגימות בדיקת הסרום ב-RT. יש לנטרל בחום דגימות סרום ואנטי-סרום ייחוס באמבט מים בטמפרטורה של 56°C למשך 30 דקות לפני השימוש. הכינו דילולים לפי תבנית הצלחת (איור 4).
- הכן דילול של 1:100 של REF. הכן מינימום של 110 μL של REF מדולל ב- DMEM + עט / סטרפטוקוקוס ללא FCS לכל צלחת בדיקה (למשל, 1.5 μL של REF בנפח כולל של 150 μL). הוסף 110 μL של 1:100 REF מדולל היטב A12 של צלחת סטרילית 96 באר U-תחתית.
- הוסף 55 μL של DMEM + עט / strep ללא FCS לבארות B12 עד H12 בעמודה 12. בצע דילול טורי של 1:2 במורד הצלחת על ידי העברת 55 μL משורה A לשורה B, ערבוב תמיסה על ידי פיפטציה של תוכן למעלה ולמטה 5 פעמים והמשך עד שורה H. השליכו את 55 μL האחרונים של המדיה כך שהנפח הסופי בכל באר יהיה 55 μL. השתמשו בטיפים חדשים עבור כל דילול.
- הכינו דילול 1:100 של דגימות בדיקת סרום. מכיוון שכל דגימות הסרום נבדקות בטריפליקט, הכינו נפח מינימלי של 110 μL/well x 3 = 330 μL לכל דגימת בדיקת סרום.
- הוסף 110 μL מכל דגימת בדיקת סרום מדוללת (1:100; S1 = סרום 1, S2 = סרום 2 וכו') לבארות התואמות A1 עד A9 וגם E1 עד E9 של הלוח הסטרילי בן 96 הקידוחים לפי איור 4.
- הוסף 55 μL של DMEM + pen/strep ללא FCS לכל הבארות המסומנות X. בצע דילולים טוריים 1:2 לפי שלב 2.2.1.3 עד שורה D (עבור דגימות 1, 2 ו- 3). השליכו את 55 μL המדיה הסופיים כך שהנפח הסופי בכל באר יהיה 55 μL. באופן דומה, בצע דילול טורי של 1:2 עבור דגימות 4, 5 ו- 6 עבור שורות E עד H.
הערה: זה חיוני כדי להשתמש טיפים חדשים עבור כל דילול.
- הוסף 55 μL של DMEM + עט / strep ללא FCS לבארות בעמודות 10 ו- 11.
- הכנת וירוס
- הפשירו במהירות בקבוקון קפוא אחד של RSV באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עד להפשרה כמעט מוחלטת והניחו מיד על קרח.
- לדלל וירוס ב- DMEM + pen / strep ללא FCS בהתבסס על ריכוז Aliquot RSV שנקבע בשלב 1.3.2. יש לבצע דילול שנותן כ-200 PFU/באר. להכין נפח כולל של 5.5 מ"ל (עבור 100 בארות).
- הכנת תערובת וירוסים-סרום
- הוסף 55 μL של הנגיף המדולל לכל הבארות של עמודות 1-9 ובארות של שורות E-H של עמודות 10 ו-11 (בקרה חיובית) בהתאם לתבנית הלוח (איור 4).
- הוסף 55 μL DMEM + עט / strep ללא FCS לכל בארות של שורות A-D של עמודות 10 ו 11 (שליטה שלילית). לדגור על הצלחת במשך 1 שעה ב 37 ° C, 5% CO2.
- חיסון וירוסים לתאי A549
- לפני השלמת תקופת הדגירה, אחזר לוחות תאים A549 שהוכנו בשלב 2.1.1. ודא כי מונושכבות תאים A549 בלוחות 96 באר הם ~ 80% חופפים.
- יש להשליך את המדיה על ידי היפוך עדין של הצלחת והכתמה קלה על מגבת נייר סטרילית סופגת. שטפו את כל הבארות עם 100 μL של PBS פעמיים, השליכו את עודפי PBS על ידי היפוך עדין של הצלחת וכתמים קלים על מגבת נייר סופגת סטרילית לאחר כל כביסה. אין לאפשר לצלחות להתייבש.
- העבר 100 μL / באר של תערובת סרום וירוסים לבארות המתאימות על צלחת התא A549 בעקבות תבנית הצלחת. לדגור על הצלחת במשך 1 שעה ב 37 ° C, 5% CO2.
- לאחר 1 שעה, באמצעות פיפטה, להוציא 90 μL / באר ולהוסיף 100 μL של מחומם מראש 1x M199 + 1.5% CMC + 2% FCS + עט / strep. צלחת דגירה במשך 3 ימים ב 37 ° C, 5% CO2.
הערה: יש לוודא שהתחמם בטמפרטורה של 37°C לפני הוספתה לצלחות.
- פיתוח צלחת בדיקה וניתוח (יום 5)
- פתח לוח קיבוע ובדיקה לפי שלבים 1.3.1.1 עד 1.3.1.8.
- קבע את שכבת הנטרול של 50%
- קבע את טיטר הנטרול של 50% על ידי חישוב המרחק היחסי בין דילולי הסרום ההדדיים מעל ומתחת ל- 50% מבארות הבקרה 'ללא סרום' (בקרת וירוסים חיובית - עמודה 10, שורות E-H).
- ספור את מספר PFU (כלומר, פלאקים) הנובעים מזיהומים ויראליים בודדים בבארות נסיוב וללא בארות בקרת נסיוב. חשב את המספר הממוצע של PFU של בארות בקרת סרום ללא סרום ולקבוע את הערך 50%.
- זהה דילול בסרום עם ספירות מיד מעל ומתחת לערך 50% של בארות הבקרה ללא סרום. באמצעות גרף יומן למחצה או תבנית גיליון אלקטרוני, התווה את מספר ה- PFU על ציר ה- x (קנה מידה ליניארי) ואת דילול הסרום ההדדי על ציר y (סולם log10). ציירו קו בין שתי הנקודות וקראו את 50% הנטרול של דגימות סרום הבדיקה מקו זה.
