$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. הכנת חיץ
- חיץ תיוג (2x מלוחים חוצצי פוספט, (PBS), pH 7.9): ב 400 מ"ל של מים מזוקקים deionized (DD), להוסיף 100 מ"ל של 10x PBS, להתאים pH ל 7.9 עם הידרוקסיד נתרן (NaOH).
- 3 מ"מ ביוטין: יש להמיס 1 מ"ג ביוטין ב-588 מיקרוליטר של מאגר התוויה.
- 3 mM של Sulfo-tag: להמיס 150 nmol של Sulfo-tag ב 50 μL של מאגר תיוג.
- מאגר אנטיגן (5% BSA): ב-500 מ"ל של PBS אחד, יש להוסיף 25 גרם אלבומין בסרום בקר (BSA).
- הכינו תמיסת חומצה אצטית 0.5 מ '.
- 1.0 מ' של חיץ Tris-HCl pH 9.0: הכינו מאגר Tris-HCl באורך 1 מ' וכוונן את ה-pH ל-9.0 עם HCl.
- חיץ ציפוי (3% חוסם A): ב-500 מ"ל של 1x PBS, הוסף 15 גרם של חוסם A.
- חיץ כביסה (0.05% טווין 20, PBST): ב 5000 מ"ל של 1x PBS, להוסיף 2.5 מ"ל של טווין 20.
- מאגר קריאה (2x Read Buffer T עם חומרים פעילי שטח): ב-500 מ"ל של מים מסוג DD, הוסף 500 מ"ל של 4x Read Buffer T עם חומרים פעילי שטח.
- יש לאחסן ביוטין וסולפו-טאג במקפיא בטמפרטורה של -20°C. < בר/>
הערה: גם תמיסות ביוטין וגם סולפו-טאג צריכות תמיד להיות מוכנות טריות ממש לפני תהליך התווית.
2. תייגו את האנטיגן האוטומטי של האי האנושי עם ביוטין וסולפו-תג
הערה: מומלץ ריכוז גבוה של אנטיגן, ≥0.5 מ"ג/מ"ל, לתגובת תיוג יעילה יותר.
- לקבוע את היחס המולרי של autoantigen האי האנושי עבור ביוטין ו Sulfo-tag.
- קבל את המספר המולרי של האנטיגן על ידי חלוקת משקל האנטיגן במשקל המולקולרי.
- השתמש ביחס מולארי של 1:5 עבור האנטיגן עם משקל מולקולרי קטן יותר (≤10 kd), ואת היחס המולרי של 1:20 עבור האנטיגן עם משקל מולקולרי גדול יותר (>50 kd).
- חשב את עוצמת הקול עבור ביוטין או תג סולפו על ידי חלוקת המספר המולרי בריכוזו.
- ערבבו את האנטיגן העצמי של האיון האנושי עם ביוטין או סולפו-טאג עם יחס מולארי של 1:5.
הערה: יש להחליף את החלבון במערכות חיץ טריס או גליצין למאגר PBS פי 2 עם pH 7.9 באמצעות עמודת ספין הגודל.
- מכיוון שביוטין וסולפו-טאג רגישים לאור, כסו את צינורות התגובה ברדיד אלומיניום. לדגור על התגובה בטמפרטורת החדר (RT) במשך שעה אחת.
- במהלך הדגירה, הכוון את עמודת הספין על ידי חלוקת חיץ PBS 2x לתוך הטור שלוש פעמים. צנטריפוגה את התמיסה ב 1000 x גרם במשך 2 דקות בכל פעם.
הערה: נכון לעכשיו תגובת התיוג, באמצעות גישור, עדיין מתרחשת וצריך לעצור אותה.
- עצור את תגובת התיוג על ידי טיהור האנטיגן האוטומטי של האי האנושי המסומן. כדי לטהר, להעביר את autoantigen דרך עמוד ספין צנטריפוגה את העמודה ב 1000 x גרם במשך 2 דקות.
- קבע את ריכוז האנטיגן המסומן (μg/μL) באמצעות כמות חלבון האנטיגן והנפח הסופי.
הערה: באופן כללי, תהיה שמירה של 90 - 95% של אנטיגן מסומן לאחר כל מעבר טור ספין.
- Aliquot האנטיגן המסומן ולאחסן אנטיגן מסומן ב -80 ° C.
3. הגדר את הריכוזים והיחסים הטובים ביותר עבור שני האנטיגנים המסומנים עבור הבדיקה (בדיקת לוח דמקה)
- הכינו שתי דגימות סרום, אחת חיובית גבוהה ואחת שלילית, בנפח כולל של 200 μL לכל אחת.
- Aliquot 4 μL של סרום ולהוסיף 1x PBS עד נפח הסופי הוא 20 μL לכל באר עבור 96-well פולימראז שרשרת תגובה (PCR) לוחית. השתמשו בחצי צלחת עבור הדגימה החיובית הגבוהה ובחצי השני עבור הדגימה השלילית, כפי שמוצג באיור 1A.
- הוסיפו 10 μL של ביוטין ו-10 μL של אנטיגן מסומן בתג Sulfo ובצעו דילולים סדרתיים עבור שני האנטיגנים המסומנים באופן שונה, כפי שמוצג באיור 1A. הפעל דילול טורי אופקי עבור אנטיגן מסומן אחד ודילול טורי אנכי עבור האנטיגן המסומן השני.
- המשך את שאר שלבי הבדיקה המתוארים ב- 5.3 עד 9.1.
- חשב את יחס האותות מהמדגם החיובי הגבוה מול כל אחד מהאותות המתאימים מהמדגם השלילי המוצג באיור 1B.
- זהה את הריכוזים הטובים ביותר עבור אנטיגנים המסומנים בביוטין ובתג סולפו על ידי בחירת נקודה עם היחס הגבוה ביותר או הקרוב ביותר בין חיובי לשלילי. שקול את אות הרקע הנמוך מהמדגם השלילי כדי לזהות את היחס.
הערה: יום הבדיקה 1 כולל את שלב 4 עד שלב 6.
4. הכן את מאגר האנטיגן באמצעות הריכוז הנכון של ביוטין / תג סולפו מסומן אנטיגן
- בחר את הריכוז הרציונלי של כל אנטיגן בהתבסס על בדיקת לוח הדמקה.
- הכינו 3 מ"ל של תמיסת אנטיגן לכל צלחת, תוך שימוש בריכוז רציונלי של ביוטין/סולפו-תג אנטיגן עבור מאגר האנטיגן.
5. דגימות סרום לדגור עם אנטיגן מסומן
הערה: ישנם שני פרוטוקולים בסעיף זה, אחד ללא טיפול בחומצה בסרום ואחד עם טיפול בחומצה בסרום. כל בדיקות הנוגדנים העצמיים של האיונים למעט בדיקת נוגדנים עצמיים לאינסולין (IAA) משתמשות בפרוטוקול רגיל ללא טיפול בחומצה בסרום משלבים 5.1 עד 5.5, ואילו בדיקת IAA מדלגת על שלבים אלה ומשתמשת בפרוטוקול עם טיפול בחומצה בסרום משלבים 5.6 עד 5.9.
- Aliquot 4 μL של סרום ולהוסיף 1x PBS עד נפח הסופי הוא 20 μL לכל באר עבור צלחת PCR 96-well.
- הוסף 20 μL של תמיסת אנטיגן מסומנת לכל באר.
- כסו את צלחת ה-PCR ברדיד אלומיניום כדי למנוע אור.
- הניחו את הצלחת על שייקר (מהירות נמוכה) ב-RT למשך שעתיים.
- מכניסים את הצלחת למקרר 4°C ודגרים לילה (18 - 24 שעות).
הערה: פרוטוקול השלבים הבא מ-5.6 עד 5.9 מיועד רק לבדיקת IAA ומבחני נוגדנים עצמיים אחרים מדלגים על שלבים אלה.
- יש לערבב 15 μL של סרום עם 18 μL של 0.5 M חומצה אצטית עבור כל דגימת סרום. דוגרים על תערובת זו ב-RT למשך 45 דקות.
- הכינו את תמיסת האנטיגן עם ריכוז רציונלי של ביוטין וסולפו-תג שמסומן באנטיגן, בהתבסס על בדיקת לוח הדמקה, באמצעות מאגר אנטיגן. בכל באר, aliquot 35 μL של חיץ אנטיגן, המכיל ביוטין ו Sulfo-tag מסומן אנטיגן, לתוך צלחת PCR חדשה.
- לפני סיום שלב הדגירה של 45 דקות (שלב 5.6), הוסף 8.3 μL של 1 M Tris pH 9.0 חיץ לצד כל באר על צלחת האנטיגן (שלב 5.6). חשוב להגביל את הערבוב בין חיץ הטריס לאנטיגן. מיד להעביר 25 μL של הסרום, אשר מטופל בחומצה, בשלב 5.6, לתוך כל באר להתסיס את הפתרון. כסו את צלחת ה-PCR ברדיד אלומיניום כדי למנוע אור.
- מניחים את הצלחת על שייקר (מהירות נמוכה) ב RT במשך 2 שעות. מכניסים את הצלחת למקרר 4 מעלות צלזיוס ומניחים לצלחת לדגור לילה (18 - 24 שעות).
6. מכינים את צלחת Streptavidin
- קחו צלחת סטרפטאבידין מהמקרר בטמפרטורה 4°C ואפשרו לצלחת להגיע ל-RT.
- ברגע שצלחת הסטרפטאבידין נמצאת ב-RT, הוסיפו 150 μL של 3% חוסם A לכל באר.
- מכסים את צלחת ה-PCR בנייר איטום.
- דוגרים על הצלחת במקרר בטמפרטורה 4°C למשך הלילה.
הערה: Assay Day 2 כולל את שלב 7 עד שלב 9.
7. העברת סרום/אנטיגן דוגר לצלחת סטרפטווידין
- למחרת, מוציאים את צלחת הסטרפטווידין מהמקרר ומשליכים את החיץ מהצלחת. הניחו כמה מגבות נייר יבשות על השולחן וטפחו על הצלחת הפוכה עד שלא יהיה יותר חיץ בתוך הבארות.
- מלאו את צלחת הסטרפטאבידין הריקה ב-150 מיקרוליטר PBST לבאר והשליכו את ה-PBST מהצלחת לשלוש שטיפות בסך הכל.
- מעבירים 30 μL של סרום/אנטיגן דוגר לכל באר לתוך צלחת סטרפטווידין.
- מכסים את הצלחת בנייר כסף כדי למנוע אור. נערו את הצלחת, במצב נמוך, ב-RT למשך שעה אחת.
8. שטפו את הצלחת והוסיפו מאגר קריאה
- יש להשליך את הדגירה מהצלחת. מוסיפים 150 מיקרוליטר PBST לבאר ומשליכים את ה-PBST מהצלחת לשלוש שטיפות בסך הכל.
- לאחר השטיפה, להוסיף 150 μL לכל באר של חיץ קריאה.
הערה: חשוב למנוע בועות אוויר בתמיסה מכיוון שהדבר ישפיע על אופן קריאת הצלחת במכונת קורא הצלחות.
