בדיקה חיסונית מבוססת נייר לזיהוי אימונוגלובולין G

תקציר

מקור: Peng, Y. et al., קשירה קוולנטית של נוגדנים לדיסקיות נייר תאית ויישומם בבדיקות חיסוניות קולורימטריות בעין בלתי.J. Vis. Exp. (2016)

הסרטון מדגים אימונואסייה מבוססת נייר, הכוללת דיסקיות תאית מתפקדות אמין המקושרות זו לזו עם גלוטראלדהיד. אימוביליזציה קוולנטית של נוגדני לכידה ספציפיים ל- IgG-Fc, ואחריה הכנסת אימונוגלובולין G ונוגדני זיהוי מצומדים של פרוקסידאז חזרת, גורמת לשינוי צבע המאשר את נוכחותו של אימונוגלובולין G.

פרוטוקול

1. השתלת קבוצות פונקציונאליות של אמין על דיסקיות נייר תאית

1. הכינו פיסת נייר מרובעת אחת במידות של 1 ס"מ × 1 ס"מ, ו-100 דיסקיות נייר העשויות מנייר תאית מס' 1 בקוטר של 6.0 מ"מ (נייר סינון בזרימה בינונית) באמצעות ניקוב חורים.
2. כדי להפיק -_{NH 2} קבוצות על דיסקיות הנייר, ערבבו 1 מ"ל 3-aminopropyltrimethoxysilane (APS) ו-10 מ"ל אצטון בבקבוק זכוכית של 50 מ"ל במכסה האדים. הוסף דיסקיות נייר לתערובת מגיב APS שזה עתה הוכנה, ודגר במשך 5 שעות עם ערבוב מסלולי (200 סל"ד) בטמפרטורת החדר.
   זהירות: טפל ב-APS ובאצטון במכסה האדים.
3. יש לרוקן את עודפי התמיסה מבקבוק זכוכית של 50 מ"ל לתוך מיכל פסולת אורגנית.
4. הוסף 10 מ"ל של אצטון לבקבוק זכוכית, לערבב היטב decant לחלוטין כדי להסיר כל APS unreacted וזיהומים אחרים. חזור על שלב זה פעמיים.
5. מורחים את דיסקיות הנייר על מגבת הנייר ומכניסים לתנור בטמפרטורה של 110°C למשך 3 שעות. מניחים לדיסקיות הנייר להתקרר. אחסנו את הדיסקיות בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל בטמפרטורת החדר.
6. השתמשו בספקטרוסקופיית אינפרא-אדום של התמרת פורייה (FTIR) כדי לבדוק את ההשתלה של קבוצות אמין על נייר ריבוע תאית, כמתואר להלן (איור 1A).
   1. הפעל את המחשב ופתח את מכשיר הספקטרוסקופיה FTIR.
   2. פתח את התוכנה עבור ספקטרוסקופיית FTIR.
   3. עבור אל 'מדידה → אתחול'. המלבנים עבור 'BS: KBr', 'מנורה: אינפרא אדום' ו- 'לייזר' יהפכו לירוקים בסיום האתחול.
   4. בחר 'נתונים' מתחת למלבנים ובחר '%Transmittance', 'Happ-Genzel', '45', '4.0' ו- 'Min: 400, Max: 4000' עבור 'מצב מדידה', 'Apodization', 'No. of Scans', 'Resolution' ו- 'Range (cm-1)'.
   5. לחצו על 'מדידה'.
   6. בחר 'קובץ נתונים' עבור נתוני הרקע. רשמו את התגובות.
   7. לחץ על 'BKG' כדי לקבל את קו הבסיס עבור הרקע.
   8. תקן את הנייר המרובע על מחזיק דוגמת הסרט.
   9. בחר 'קובץ נתונים' עבור הנתונים לדוגמה. רשמו את התגובות.
   10. לחץ על 'מדגם' כדי לקבל את הספקטרום עבור הדגימה.
   11. סגור את יישום ספקטרוסקופיית FTIR וכבה את המחשב.
7. חזור על השלבים לעיל (שלבים 1.1 עד 1.6) כדי להכין נייר ודיסקים מרובעים של תאית בדרגה 113 (נייר סינון בזרימה מהירה), וקבל את ספקטרום FTIR עבור נייר מרובע מס' 113 (איור 1B).

2. בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים מבוססת נייר (ELISA) לזיהוי אימונוגלובולין G (IgG)

1. יש להוסיף 5 מ"ל של תמיסת גלוטראלדהיד 0.05% (מוכנה במאגר PBS של 50 מ"מ, pH 7.4) לבקבוק זכוכית של 20 מ"ל. יש לטבול בתמיסה זו 15 דיסקיות נייר עם סינון בזרימה בינונית המותאמות לשימוש באמין ולשמור למשך שעה אחת עם רעידות בטמפרטורת החדר.
   1. במקביל, חזור על שלב 2.1 כדי להכין עוד 15 דיסקי נייר סינון בזרימה מהירה של אלדהיד.
      זהירות: טפל בגלוטאראלדהיד במכסה האדים.
2. כדי להסיר גלוטראלדהיד שלא מגיב מדיסקי הנייר, מקם את 15 דיסקיות נייר הסינון בזרימה בינונית בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל, ואת 15 דיסקיות נייר המסנן בזרימה מהירה בצינור צנטריפוגה נוסף של 15 מ"ל. הוסיפו 5 מ"ל של מי DI לכל צינור ונערו את הצינורות למשך 10 שניות. מוציאים את המים על ידי שאיפה עם פיפטה. יש לחזור על הפעולה פעמיים כדי להסיר גלוטראלדהיד שלא מגיב.
3. יבשו את דיסקיות הנייר בתנור בטמפרטורה של 37°C.
4. הוסף 5 μl ו- 8 μl של 0.025 מ"ג / מ"ל עכבר נוגדני מקטע IgG-Fc לכל אחד מדיסקי נייר מסנן זרימה בינונית וזרימה מהירה, בהתאמה, ודגור במשך 20 דקות.
5. הוסף 10 μl של 50 mM PBS (pH 7.4) לכל דיסק נייר מבלי להסיר את הנוגדנים ודגר במשך 40 דקות עבור תגובת אמין אלדהיד.
6. שטפו את דיסקיות הנייר עם 0.2 מ"ל של חיץ כביסה על גבי מגבת נייר. חזרו על הכביסה שלוש פעמים.
7. יבש את דיסקיות הנייר בתנור ב 37 ° C.
8. חסום את דיסקיות הנייר עם 15 μl של חיץ חוסם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
9. שטפו כל דיסק נייר עם 0.2 מ"ל של חיץ כביסה על גבי מגבת נייר. חזרו על הכביסה שלוש פעמים.
10. הפעל תקני IgG.
    1. טען 10 μl של ריכוזי IgG שונים (למשל, 0, 10, 125, 250 ו- 500 ng/ml ב- PBS) על כל דיסק במשולש. יש לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
11. שטפו את דיסקיות הנייר עם 0.2 מ"ל של חיץ כביסה על גבי מגבת נייר. חזרו על הכביסה שלוש פעמים.
12. יש לטעון 10 μl של נוגדני מקטע IgG-Fc מצומדים של עכבר HRP (1:10,000, 10 mM PBS, pH 7.4), ולדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
13. שטפו את דיסקיות הנייר עם 0.2 מ"ל של חיץ כביסה על גבי מגבת נייר. חזור על הכביסה שלוש פעמים.
    הערה: אין צורך להסיר את חיץ הכביסה מכיוון שהתוצאות אינן מושפעות מנוכחות חיץ.
14. טען תערובת של 10 μl של TMB ומי חמצן על כל דיסק.
15. צלם תמונות של כל דיסקי הנייר באמצעות מצלמה דיגיטלית או טלפון חכם לאחר 5 דקות של דגירה.
    הערה: באיור 2A, '0' מייצג דיסקיות נייר שטופלו באימוביליזציה של נוגדנים לכידה, ותמיסת נוגדן-HRP/TMB ללא נסיוב IgG.
16. נתח את העוצמה של כל דיסק נייר בתמונה לפי תמונה J.
    1. המר את התמונות שצולמו בשלב 3.15 לפורמט '.tif'.
    2. פתח את תוכנת 'Image J'.
    3. עבור אל 'קובץ → פתח', בחר את התמונה לניתוח.
    4. בחר את לחצן הצורה 'אליפסה'.
    5. עבור אל 'תמונה → הקלד → 32 סיביות'.
    6. עבור אל 'ערוך → הפוך'.
    7. עבור אל 'נתח → מדידה'.
    8. העתק ונתח את הנתונים בגיליון אלקטרוני.

תוצאות

איור 1.ספקטרום אינפרא אדום התמרת פורייה (FTIR) של נייר מרובע של מסנן זרימה בינונית (A) לא מטופל ומטופל APS ונייר מרובע של מסנן זרימה מהירה (B). א. הספקטרום עבור נייר מרובע של מסנן זרימה בינונית שלא טופל היה דומה לזה של נייר מרובע מסנן זרימה בינונית שטופל ב- APS. העלייה בעוצמות ברצועות של 902-1,170 ^cm-1 ו-1,210-1,500 ^cm-1 עבור נייר מרובע שטופל ב-...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נייר מסנן תאית, דרגה 1 (נייר סינון זרימה בינונית)	GE Healthcare Pte בע מ סינגפור	1001 110
נייר מסנן תאית, כיתה 113 (נייר סינון זרימה מהירה)	Sigma-Aldrich, סינגפור	1113-320
3-Aminopropyltrimethoxysilane	Sigma-Aldrich, סינגפור	T1255	>96%
גלוטראלדהיד	Sigma-Aldrich, סינגפור	G6257	דרגה II, 25% ב-H2O
אלבום סרום בקר	Sigma-Aldrich, סינגפור	A2153
אבקת חלב דל שומן	לואי פרנסואה		חוות דעת על Packed by Kitchen Capers , סינגפור
בסיס טריס	פרומגה	H5135
נתרן פריודט	מרק	106597
Na2HPO4	מרק	106585
KH2PO4	מרק	104873
NaCl	קלביוכם	567441
נאוה	מרק	106462
HCL	מרק	100317
מלח חיץ פוספט (PBS)	לא ישים	לא ישים	PBS, המכיל 137 mmol / L NaCl, 2.7 mmol / L KCl, 8.0 mmol / L Na2HPO4 ו 1.5 mmol / L KH2PO4, מוכן עם מים ומותאם ל- pH 7.4 עם 0.1 mol / L NaOH או 0.1 mol / L HCl
אצטון	Tee האי Chem Pte בע מ סינגפור	9005-68
תערובת של TMB ותמיסת מי חמצן	פתרון אולטרה TMB-ELISA בצעד אחד, Thermo Scientific Pierce	34029	1 ליטר
זיקה נוגדן ציפוי IgG-Fc מטוהר נגד עכבר	Bethyl Laboratories, Inc	A90-131A
סרום ייחוס לעכבר	Bethyl Laboratories, Inc	RS10-101-5	9.5 מ"ג/מ"ל
נוגדן מצומד לזיהוי IgG-Fc נגד עכבר של HRP	Bethyl Laboratories, Inc	A90-131P
ציוד
ספקטרופוטומטר אינפרא אדום התמרת פורייה	Shimadzu IR פרסטיז'-21	לא ישים
תנור	NUVE FN500	לא ישים
מערבל טורבו VM-2000	MYC בע"מ	לא ישים
תמונה J	RGB, להורדה בחינם	לא ישים

עז