בדיקת מבחנה להערכת השפעת נוגדנים על ביופילם קנדידה טרופיקליס

תקציר

מקור: Chandley, P., et al. A Soluble Tetrazolium Based Reduction Assay to Assessment of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms. J. Vis. Exp. (2022).

סרטון זה מדגים טכניקה במבחנה לחקר השפעת נוגדנים על ביופילמים פטרייתיים. הפטרייה הפתוגנית Candida tropicalis מפרישה גורם אלים המופרש aspartyl proteinase 2 (Sap2), מה שמקל על היווצרות ביופילם. עם החדרת סרום מומת חום המכיל נוגדנים ספציפיים ל-Sap2 המעכבים את הבשלת הביופילם, נבדקת הכדאיות של התאים הפטרייתיים באמצעות בדיקה כרומוגנית.

פרוטוקול

1. היווצרות ביופילם טרופיקליס

1. הכינו ביופילמים של קנדידה בלוח מיקרוטיטר פוליסטירן בעל תחתית שטוחה של 96 בארות כפי שתואר קודם לכן (איור 1).
2. הוסיפו 100 μL של תרבית C. tropicalis (מ-10⁶ תאים/מ"ל, שהוכנו לעיל) לצלחת מיקרוטיטר של 96 בארות באמצעות פיפטה רב-ערוצית (איור 2A). שמור על שתי העמודות האחרונות (11 ו -12) כ"ללא פטרייה פלוס נסיוב" ו"ללא פטרייה וללא סרום" על ידי הימנעות מהוספת תאים פטרייתיים. מלא עמודות 11 ו- 12 ב- 100 μL של Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Morpolinepropanesulfonic acid (MOPS) medium בלבד.
3. מכסים את צלחת המיקרוטיטר במכסה ובנייר אלומיניום. לדגור על הצלחת במשך 24 שעות ב 37 ° C בתנאים נייחים.
4. למחרת, שאפו את המדיום בזהירות באמצעות פיפטה רב ערוצית (מבלי לגעת או להפריע לביופילמים). הקש על הצלחת בעדינות במצב הפוך על דפי כתמים כדי להסיר שאריות תווך.
5. שטפו את הצלחת עם 200 μL של 1x מי מלח חוצצים פוספט (PBS) (לכל באר) באמצעות פיפטה רב ערוצית. הוסיפו PBS בעדינות רבה לאורך הדפנות הצדדיות של הבאר כדי למנוע הפרעה לביופילמים. שאפו את PBS בזהירות באמצעות פיפטה רב ערוצית. חזור על שטיפת PBS 2x (סה"כ שלוש כביסות).
6. כדי להסיר עודפי PBS, יבשו את הצלחת באוויר (ללא המכסה) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, בתוך ארון בטיחות ביולוגי.

2. טיפול בביופילם עם נוגדנים

הערה: כעת ניתן לעבד ביופילמים להערכת עיכוב הבשלת ביופילם על ידי נוגדנים. סרום מורין שימש כמקור לנוגדנים רב-שבטיים (polyclonal antibodies). קבוצות שונות של עכברים שחוסנו ל-Sap2 (Sap2-albicans, Sap2-tropicalis ו-Sap2-parapsilosis) יחד עם עכברים שחוסנו בדמה רטרו-מסלולית והסרום בודד. נוכחותם של נוגדנים נגד Sap2 אושרה באמצעות בדיקת אימונוסורבנט ספציפית לאנזים Sap2 (ELISA).

1. יש לבצע נטרול חום של הסרום (מקור נוגדנים רב-שבטיים) ב-56°C למשך 30 דקות לפני השימוש כדי לשלול את תפקיד המשלים בפעילות המעכבת. יש לחמם את הסרום לפני ביצוע דילול הסרום.
   הערה: השתמשו בסרום מעכברים שעברו חיסון מזויף, עכברים קדם-חיסוניים וסרום מדולל נוגדנים ספציפי ל-Sap2 כאמצעי בקרה נוספים. סרום נטול נוגדנים הוכן לפי מחקר קודם. מבין הדילולים הסדרתיים (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1,600, 1:3,200, 1:6,400 ו-1:12,800) עבור נסיוב שנבדקו בפרוטוקול זה, נצפתה עיכוב של הבשלת ביופילם ב-1:25, 1:50 ו-1:100; לפיכך, 1:50 נבחר כדי לאזן בין עיכוב לבין צריכת נסיוב.
2. הכינו דילולים סדרתיים של דגימות סרום מומתות חום במדיום סל"ד סטרילי 1640 MOPS (1:50). השתמש בדילול סרום משותף (1:50) עבור כל דגימות הסרום כדי להיבדק לעיכוב הבשלת ביופילם.
3. הוסף 100 μL של דילול הסרום שנבחר לכל באר של צלחת microtiter 96-well. עבור כל דגימה, הוסיפו דילולי סרום כפולים, בהתאם לפריסה המצורפת (איור 2B).
   1. בעמודה 10, אין להוסיף דילול בסרום; הוסף רק RPMI 1640 MOPS בינוני עבור הבקרה החיובית של פטרייה בלבד.
      הערה: עמודה 10, שורות G1-G8 ו- H1-H8 הכילו בתחילה תאים פטרייתיים ב- RPMI-MOPS. עם זאת, בעוד RPMI-MOPS נוסף לעמודה 10 גם לאחר 24 שעות, שורות G1-G8 שימשו כבקרת PBS ושורות H1-H8 כבקרה ללא נסיוב לאחר 24 שעות.
   2. בטור 11, הוסף דילול של 1:50 של הסרום לכל הבארות כדי לשמש כבקרה שלילית ללא פטרייה פלוס בסרום.
   3. בטור 12, אל תוסיפו דילול בסרום לשום באר; שמרו על זה כבקרה שלילית ללא פטרייה בסרום.
4. מכסים את הצלחת במכסה ובנייר אלומיניום. לדגור על הצלחת במשך 24 שעות ב 37 ° C.

3. הערכת פעילות מטבולית של ביופילם

1. למחרת, שאפו את הסרום בזהירות באמצעות פיפטה רב ערוצית (מבלי לגעת או להפריע לביופילמים). הקש על הצלחת בעדינות במצב הפוך על דפי כתמים כדי להסיר שאריות סרום.
2. שטפו את הצלחת עם 200 μL של 1x PBS (לכל באר) באמצעות פיפטה רב ערוצית, הוספת PBS לאורך הדפנות הצדדיות של הבאר כדי למנוע הפרעה לביופילמים. שאפו את PBS בזהירות באמצעות פיפטה רב ערוצית וחזרו על שטיפת PBS 2x (סה"כ שלוש כביסות). יבשו את הצלחת באוויר (ללא המכסה) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, בתוך ארון בטיחות ביולוגי כדי לייבש עודפי PBS.
3. הכנת XTT(2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-Carboxanilide)/menadione:
   1. הכינו XTT בצלצולים סטריליים לקטט כתמיסה של 0.5 גרם/ליטר. יש להמיס 25 מ"ג XTT ב-50 מ"ל של רינגרס לקטט מעוקר בפילטר. Aliquot 10 מ"ל בצינורות נפרדים מכוסים ברדיד אלומיניום ולאחסן ב -80 ° C.
   2. הכינו את המנדיון כמלאי של 10 מיליון. להמיס 8.6 מ"ג של menadione ב 5 מ"ל של אצטון ולהפיץ 50 μL ב 100 microtubes נפרדים. אחסן את aliquots ב -80 °C.
   3. הכינו תמיסת XTT/מנדיון ממש לפני השימוש על ידי לקיחת 10 מ"ל XTT והוספת 1 מיקרוליטר של מנדיון לקבלת תמיסת עבודה של 1 מיקרומטר.
4. הוסף 100 μL של תמיסת XTT/menadione לכל באר של צלחת microtiter 96-well. מכסים את הצלחת במכסה ובנייר אלומיניום. לדגור על הצלחת במשך 2 שעות ב 37 ° C בחושך.
5. מעבירים 80 מיקרוליטר של הסופרנאטנט הצבעוני מכל באר לצלחת טרייה בת 96 בארות. קרא את הצלחת ב 490 ננומטר.
6. חשב את ממוצע ערכי הספיגה של הבארות בעמודה 10 (בקרה חיובית לפטרייה בלבד), אשר ישמש ערך ייחוס לחישוב אחוז עיכוב הביופילם על ידי כל דגימת סרום באמצעות משוואה (1).
   % עיכוב ביופילם = 100 - × 100 (1)

תוצאות

איור 1: הדמיה של ביופילם קנדידה טרופיקליס.(A) הדמיה של ביופילם קנדידה טרופיקליס שנוצר בתחתית לוח מיקרוטיטר בעל 96 בארות לאחר הסרת תווך RPMI, באמצעות מיקרוסקופ הפוך. התמונה צולמה באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד (לא נעשה שימוש בכתם). (B) הדמיה של ביופילם C. tropicalis שנוצר בתחתית לוח מיקרוטיטר בעל 96 בארות לאחר צביעה סגולה קריסטלית. (C

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
15 מ"ל צינורות צנטריפוגות חרוטיות	BD בז	546021
1x PBS	-	מוכן במעבדה	NaCl : 4 גרם KCl : 0.1 גרם Na2HPO4: 0.72 גרם KH2ת.ד. 4 : 0.12 גרם מים 500 מ"ל. כוונן את ה- pH ל- 7.4
50 מ"ל צינורות צנטריפוגות חרוטיות	BD בז	546041
צלחות מיקרוטיטר 96 בארות	אנונימי	442404
אינקובטור	כללי
מנדיון	סיגמא	M5625
קורא לוחות Microtiter	כללי
פיפטה רב ערוצית וטיפים	כללי
צלחות פטרי	טרסון	460090
רינגרים לקטט	-	מוכן במעבדה	נתרן כלורי 0.6 גרם נתרן לקטט 0.312 גרם אשלגן כלורי 0.035 גרם סידן כלורי 0.027 גרם מים 100 מ"ל. כוונן ל- pH 7.0
RPMI 1640 MOPS	היימדיה	AT180
XTT	Invitrogen	X6493