שיטה מבוססת אימונופלואורסנציה להדמיית תאי Tuft בקריוקציות Jejunum

תקציר

מקור: Mizutani, Y. et al., שימוש בנוגדנים נגד פוספו-גירדין כדי לדמיין תאי Tuft של המעי בקריוסקציות ג'ג'ונום של עכבר צף חופשי.J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים שיטה מבוססת אימונופלואורסנציה להדמיית תאי ציצית מעיים בקריוסקציות ג'ג'ונום של עכבר צף חופשי. בתוך וילי המעי, לוקליזציה משותפת של פלואורסצנטיות ירוקה בקצה הלומינלי עם מסת שורש אדומה מורחבת מצביעה על נוכחות של תאי ציצית.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנות

1. הכן 10 ליטר של מלח חוצץ פוספט (PBS): 32.27 גרם נתרן מימן פוספט (Na₂HPO₄·12H₂O), 4.5 גרם נתרן דימימן פוספט (NaH₂PO₄·2H₂O), 80.0 גרם נתרן כלורי (NaCl) הוסיף למים טהורים במיוחד לנפח סופי של 10 L. יש לאחסן תמיסה בטמפרטורת החדר (RT).
2. הכן 200 מ"ל של PBS-T: 200 מ"ל של PBS משלב 1.1 עם 100 μL של אתר פוליאוקסאתילן (10) אוקטילפניל לריכוז סופי של 0.05% (vol: vol). יש לאחסן ב-RT.
3. בעת לבישת כפפות והגנה על העיניים, הכינו 50 מ"ל של 15% סוכרוז בתמיסת פורמלין ניטרלית חוצצת 10%: 7.5 גרם סוכרוז נוסף לתמיסת פורמלין נייטרלי חוצץ 10% (טבלת חומרים) לנפח סופי של 50 מ"ל. אחסון בכתובת RT.
   זהירות: שאיפה ו/או מגע עור/עין עם פורמלדהיד בתמיסת פורמלין ניטרלי חוצץ 10% עלולה להיות מסוכנת. טפל בזהירות.
4. הכן 1.5 מ"ל של 200 יחידות/מ"ל תמיסת מלאי מצומדת צבע פלואדין-פלואורסצנטי: צימוד צבע פלואידי-פלואורסצנטי (300 יחידות בבקבוקון אחד, מוצקים ליופיליים, עירור ואורכי גל פליטה: 581 ננומטר ו-609 ננומטר, בהתאמה) מרחף ב-1.5 מ"ל מתנול. אחסנו את התמיסה בחושך בטמפרטורה של -20°C.
5. הכן 5 מ"ג / מ"ל 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) תמיסת מלאי: 10 מ"ג של DAPI ב 2 מ"ל של N, N-dimethylformamide (DMF). אחסנו את התמיסה בחושך בטמפרטורה של -20°C.
6. הכינו אלבומין בסרום בקר 5% (BSA) ב-PBS: 0.5 גרם BSA, 10 מ"ל PBS. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
7. הסירו את הקצה המשופע של מחט ישרה בעלת 18 מד באמצעות פטמה, וצבטו את הקצה המשופע עם פינצ'ר בכיוון ארוך כדי לאפשר לנוזל לזרום דרך לומן המחט (איור 1A1).
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

2. נתיחת בעלי חיים ובידוד ג'ג'ונום

1. קיבוע זילוח של עכבר
   1. ללבוש כפפות ולעבוד באזור מאוורר היטב.
   2. הכינו זכוכית 100 מ"ל, תמיסת פורמלין נייטרלית חוצצת 10%, כלי ניתוח (מספריים, מלקחיים), מגש מתכתי, תפרים חתוכים 6-0 בניילון, מחט ישרה 18 מד מוכנה כמו ב 1.7, מחט מכונפת 22 מד, מזרק 20 מ"ל.
   3. טען 20 מ"ל של תמיסת פורמלין נייטרלי חוצצת 10% מכוס הזכוכית לתוך מזרק 20 מ"ל וחבר את המחט המכונפת 22 מד לשקע.
   4. הכינו ג'לטין נוזלי על ידי הוספת גרם אחד של אבקת ג'לטין ל-20 מ"ל PBS (5% ג'לטין סופיים) בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. לאחר השריה ב-RT במשך 15 דקות, יש לדגור ב-50 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך 15 דקות ללא רעידות.
   5. מערבלים לזמן קצר ודגרים ב 50 ° C במשך 15 דקות נוספות כדי להמיס לחלוטין את הג'לטין. השאר את הצינור ב- RT עד לשימוש.
   6. הרדימו עכבר בוגר על ידי נקע צוואר הרחם.
   7. מניחים את העכבר משלב 2.1.6 על מגש מתכתי ומבצעים חתך קטן בעור דרך סחוס הסנספורם באמצעות כלי ניתוח.
   8. הרחב את החתך בשתי הידיים כדי לחשוף את אזורי החזה והבטן.
   9. פתח את הצפק כדי לחשוף את הסרעפת, ולאחר מכן פתח את הסרעפת משני הצדדים.
   10. חתכו את כלוב בית החזה לאורך קווי בית השחי הקדמיים משני הצדדים, ולאחר מכן הסירו את דופן בית החזה על ידי חיתוך בכיוון רוחבי במיקום בלוטת התימוס כדי לחשוף את הלב.
   11. בצע חתך קטן על האוריקל של אטריום ימין כדי לנקז את הדם ולהכניס מחט מכונפת 22 מד לתוך קודקוד החדר השמאלי. דחפו את הבוכנה כדי לחורר את הרקמות עם תמיסת פורמלין נייטרלית חוצצת 10%.
   12. לאחר חשיפת איברים באגן, חותכים את קצה פי הטבעת מפי הטבעת, ומפרידים את המעיים מהגוף על ידי חיתוך המזנטריה.
   13. כדי לבודד את jejunum, לחתוך את המעיים ב 4 ס"מ מן הצד האנאלי של אנטרום קיבה. יש להשליך את המחצית האנאלית של המעי הדק הנותר.
   14. חותכים את הג'ג'ונום לשניים כדי להקל על הליך השטיפה. טען 20 מ"ל של תמיסת פורמלין נייטרלי חוצצת 10% לתוך מזרק 20 מ"ל, וחבר את המחט הישרה 18 מד מוכן בשלב 1.7 לשקע.
   15. הזריקו תמיסת פורמלין נייטרלי חוצצת 10% מקצה אחד של הג'ג'ונום החתוך כדי לשטוף את תוכן המעי ולקבע את פני השטח של לומן המעי (איור 1A2).
   16. יש לשטוף את לומן המעי על ידי הזרקת PBS כמתואר בשלב 2.1.15.
   17. יש לשטוף ג'לטין נוזלי לתוך לומן המעי כמתואר בשלב 2.1.15 כדי להחליף PBS בג'לטין נוזלי.
   18. סגור קצה אחד של הג'ג'ונום החתוך על-ידי קשירת תפרים באמצעות תפר חתוך ניילון 6-0, מלא את הג'ג'ונום בג'לטין נוזלי, וסגור את הקצה הנגדי על-ידי קשירת תפרים (איור 1A3).
   19. הוסיפו ארבעה קשרי תפרים כדי להתאים קטע ג'ג'ונום בצורת נקניק לחלק המדוכא של קריומולד (איור 1A4).
       הערה: עבור cryomolds עם 20 מ"מ x 25 מ"מ x 5 מ"מ קטע מדוכא, ~ 20 מ"מ נקניק כמו קטע jejunum עדיף.
   20. יש להשרות את הרקמות ב-50 מ"ל של 15% סוכרוז בתמיסת פורמלין נייטרלית חוצצת 10% למשך הלילה ב-4°C.
       הערה: צעדים אלה מבטיחים הגנה קריופרוטקטורית על ידי סוכרוז וקיבוע חלבון על ידי פורמלין של ג'לטין ורקמות. ג'לטין ג'לטין פורמלין אינו נמס ב- RT, ואילו ג'לטין ג'לטין לא קבוע ב- 4 ° C נמס ב- RT.

3. הקפאה מהירה של רקמות ג'ג'ונום מלאות ג'לטין

1. על-ידי חיתוך הג'ג'ונום בקשרי התפרים, מתקבלות שלוש חתיכות ג'ג'ונום דמויות נקניק ששני קצותיהן קשורים (איור 1A4). יישרו את החתיכות דמויות הנקניק בהקפאה לתוספת של תרכובת הטבעה להכנת דגימות רקמה קפואות.
2. הצמד להקפיא את cryomold ב isopentane מקורר עם חנקן נוזלי. יש לאחסן cryomolds בטמפרטורה של -80°C
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

4. אימונופלואורסנציה של תאי Tuft באמצעות קריוסקציות צפות חופשיות

1. קריוסקציה
   1. הגדר הן את טמפרטורת תא הקריוסטט (CT) והן את טמפרטורת האובייקט (OT) ל- -22 °C. הניחו את גוש הרקמה הקפואה בקריומולד בתא ההקפאה למשך 15 דקות לפחות.
   2. הוסיפו 3 מ"ל PBS לצלחת תרבית של 35 מ"מ.
   3. הסר את גוש הרקמה הקפואה מהקריומולד וחתך את הבלוק לשניים עם סכין גילוח כדי לחשוף את החלק הרוחבי של הג'ג'ונום. הרכיבו מחצית אחת של הבלוק על צ'אק (מתאם קריוסטטים) כדי לחלק את מישור החיתוך עם סכין הגילוח.
   4. חתכו את הג'ג'ונום המלא בג'לטין למקטעים בעובי 30 מיקרומטר. השתמשו במלקחיים קפואים כדי להעביר בעדינות את החלקים לצלחת התרבית בקוטר 35 מ"מ שהוכנה בשלב 4.1.2 (איור 2B, מימין).
2. יישום נוגדנים ראשוניים
   1. שטפו את החלקים הצפים בצלחת התרבית בקוטר 35 מ"מ 3 פעמים למשך 5 דקות כל אחד עם 3 מ"ל PBS-T עם ניעור עדין על שייקר הדדי (בערך 36 פעמים לדקה).
   2. הכנת תמיסת אחזור אנטיגן: 0.3 מ"ל של תרכיז תמיסת אחזור אנטיגן (טבלה של חומרים) ב 2.7 מ"ל של מים טהורים במיוחד. הוסף 3 מ"ל של תמיסת אחזור אנטיגן לצלחת התרבית 35 מ"מ המכילה חלקים צפים חופשיים.
   3. סוגרים את המכסה, אוטמים את הרווח בין המנה למכסה עם רצועה של סרט ויניל, ודגרים בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס באינקובטור הכלאה למשך 3 שעות ללא רעידות.
   4. מוציאים את המנה מהאינקובטור ומצננים ב-RT למשך 20 דקות. לאחר הסרת סרט הויניל, שטפו את החלקים 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 3 מ"ל של PBS-T ורעד קל.
   5. שאפו את PBS-T והוסיפו 5 טיפות של תמיסת חסימה (טבלת חומרים) על המקטעים. יש לדגור ב-RT במשך 5 דקות עם רעידות קלות.
   6. הכן את תמיסת הנוגדנים הראשונית: 495 μL של 5% BSA ב- PBS עם 5 μL של נוגדני פוספו-Y1798 גירדין (pY1798) (טבלת חומרים). הוסף 500 μL של תמיסת נוגדנים ראשונית לסעיפים (אין צורך להסיר את הפתרון החוסמ).
   7. הניחו את התבשיל בתא דגירה לח ודגרו למשך הלילה על 4 מעלות צלזיוס עם רעידות קלות.
      הערה: ניתן להאריך את הדגירה ללילה עד שלושה לילות.
3. יישום נוגדנים משניים
   1. שטפו את החלקים 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד ב-3 מ"ל של PBS-T עם רעידות קלות.
   2. הכן תמיסת מלאי DAPI מדוללת: 2 μL של תמיסת מלאי DAPI (שלב 1.5), 998 μL של PBS.
   3. יצירת תמיסת נוגדנים משנית: 476 μL של 5% BSA ב- PBS, 10.5 μL של תמיסת DAPI מדוללת, 12.5 μL של תמיסת מלאי מצומדת צבע פלואידי-פלואורסצנטי, 1 μL של צימוד צבע IgG-פלואורסצנטי נגד ארנב עיזים (אורך גל: עירור 496 ננומטר, פליטה 520 ננומטר).
   4. לאחר שאיפת PBS-T, יש למרוח את תמיסת הנוגדנים המשנית ולדגור בתא דגירה מסוכך אור ב-RT למשך 30 דקות עם רעידות קלות.
   5. שטפו את המקטעים 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 3 מ"ל של PBS-T וניעור קל.
   6. לאחר השטיפה הסופית, הסר את PBS-T והחלף אותו ב- 3 מ"ל של PBS חסר אתר פוליאוקסאתילן(10) אוקטילפניל. מעבירים את המנה למיקרוסקופ סטריאוסקופי.
   7. מניחים 200 μL של PBS בטיפה במרכז מגלשת זכוכית לבנה מצופה MAS ומעבירים קטע ג'ג'ונום אחד מהצלחת לתוך הטיפה באמצעות קצה פיפט P200.
   8. לאחר התאמת יישור המקטע תחת המיקרוסקופ הסטריאוסקופי, יש לשאוף את כל ה-PBS הנותרים סביב המקטע.
   9. הוסף 20 μL של אמצעי הרכבה מימיים והנח כיסוי בגודל 20 x 20 מ"מ על גבי המדיה.
   10. אטמו מיד את קצוות הכיסוי באמצעי הרכבה על בסיס קסילן. הניחו את המגלשה על מפת עץ ואפשרו למדיית ההרכבה מבוססת הקסילן להתמצק ב-RT למשך 2-3 שעות.
       הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. לאחר שמדיית ההרכבה מבוססת הקסילן מתמצקת, ניתן לאחסן את השקופיות למשך שבועיים - שלושה בקופסת שקופיות עם סיכוך אור ב- RT.

5. מיקרוסקופ קונפוקלי

1. שים שמן טבילה על המטרה 63X של מיקרוסקופ קונפוקלי. סובב את מגלשת הכיסוי כלפי מטה והנח את המגלשה על הבמה.
2. הפוך את תמונות TC המתקבלות לדיגיטליות באורכי גל לייזר של 405, 488 ו- 555 ננומטר ושמור את התמונות בפורמט tiff (.tiff).
   הערה: בחר ערכת סינון זיהוי המתאימה לצבעים הפלואורסצנטיים (כלומר, מקסימום עירור/פליטה: 358/461 ננומטר, 490/525 ו- 590/617).

תוצאות

איור 1: מילוי ג'לטין של מקטעי ג'ג'ונום לשימור מורפולוגי של קריוסקציות
(A) צילומים של הליכים למילוי תוך-לומינלי של ג'ג'ונום עכברי בג'לטין. (A1) קצה משופע של מחט ישרה בעלת 18 מד הוסר כדי למנוע פירסינג בדופן המעי. (A2) תמיסת פורמלין נייטרלית חוצצת (10%) הוזרק בקצה אחד של הג'ג'ונום החתוך כדי לשטוף את תוכן המעי ולתקן את פני לומן המעי. (A3)

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Slc:DDY נקבת עכברים בת 6 שבועות	צ'ובו קאגאקו שיזאי	לא ישים
דיסודיום הידרוגנפפוספט 12-מים (Na2HPO412H2O)	וואקו	196-02835
נתרן דיהידרואנפוספט דיהידרט (NaH2PO42H2O	וואקו	199-02825
נתרן כלורי (NaCl)	וואקו	199-10665
טריטון X-100, אתר פוליאוקסיאתילן(10) אוקטילפניל	קטאיאמה כימיקל	לא ישים
סוכרוז	וואקו	190-00013
תמיסת פורמלין נייטרלית חוצצת 10%	מוטו כימיקל	20215	שלב 1.3.
צבע פלואדין-פלואורסצנטי מצומד, אלקסה פלואור 594 פלואידין	תרמופישר סיינטיפיק	A12381
מתנול	Nacalai Tesque	21915-35
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)	תרמופישר סיינטיפיק	D1306
N.N-דימתילפורממיד (DMF)	Nacalai Tesque	13015-75
אלבומין בסרום בקר	סיגמא	A9647-10G
מחט ישרה מפלדת אל-חלד 18 מד	תרומו	NN-1838R
U.S.P. 6-0, תפר חתך ניילון 60 ס"מ, Crownjun	קונו סייסקושו	לא ישים
מחט מכונפת 22 מד	תרומו	SV-22DLK
20 מ"ל מזרק TERUMO	תרומו	SS-20ES
צינור צנטריפוגה 50 מ"ל	TPP	91050
15 מ"ל צינורות צנטריפוגות איוואקי	איוואקי	2325-015
1.5 מ"ל מיקרו מבחנה	כוכב	RSV-MTT1.5
אבקת ג'לטין, ג'לר-בלאן	ניטה ביולאב	2809
תרכובת הטבעה לדגימת רקמה קפואה, תרכובת O.C.T. 118 מ"ל 12 חתיכה	סאקורה פינטק	4583
Cryomold, צלחת CRYO מס '3, 125 חתיכה, גודל באר 20 x 25 x 5 (מ"מ)	שואי וורק'ס	1101-3
איזופנטאן	Nacalai Tesque	26404-75
צלחת תרבית תאי בז 35 x 10 מ"מ קלה לאחיזה	קורנינג	353001
תרכיז תמיסת אחזור אנטיגן, פתרון אחזור מטרה pH 9 10x	דקו	S2367	תרכיז תמיסת אחזור אנטיגן בשלב 4.2.2.
בלוק חלבון	דקו	X0909	פתרון חסימה ב 4.2.5.
נוגדני Phospho-Y1798 girdin (pY1798)	מעבדות אימונו-ביולוגיות (IBL) = חברה X	28143	Phospho-Y1798 נוגדנים girdin בשלב 4.2.6.
עז נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני צולב מאוד, Alexa Fluor 488	תרמופישר סיינטיפיק	A11034
מדיה הרכבה Aquous, הארכת זהב Antifade mountant	תרמופישר סיינטיפיק	P36930
Coverslips, Matsunami מיקרו כיסוי זכוכית 22 x 22 מ"מ 100 יח ' עובי מס '1	זכוכית Matsunami	C022221
אנטלן מדיית הרכבה חדשה מבוססת קסילן למיקרוסקופיה	מרק מיליפור	107961
זכוכית שקופיות מצופה MAS לבן	זכוכית Matsunami	MI-MAS-01
מיפוי עץ מסוג KO	שואי וורק'ס	99-40007
שמן טבילה 518 F ללא פלואורסצנטיות 20 מ"ל	זיס	444960
פיפטה, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000)	גילסון	F144801, F123600, F123601 F123602
מערכת ייצור מים טהורים במיוחד	אדוונטק	GS-590
כפפת פלסטיק, כפפת כוכב ניטריל	כוכב	RSU-NGVM
קריוסטט	לייקה מיקרוסיסטמס	CM1950
מקפיא עמוק, SANYO Ultra Low	סאניו	MDF-382
מקרר ראווה	מקפיא ניהון	NC-ME50EC
אמבט מים, Thermominder SDminiN (להמסת ג'לטין ב 50 C)	טאיטק	0068750-000
אינקובטור הכלאה (לשליפת אנטיגן ב-50 מעלות צלזיוס)	טאיטק	HB-100
תא דגירה לכתמים חיסוניים	קוסמו ביו	10DO
שייקר הדדי לאימונוהיסטוכימיה (לטמפרטורת החדר)	טאיטק	NR-1
שייקר הדדי לאימונוהיסטוכימיה (עבור 4 C)	טוקיו ריקה קיקאי	MMS-3010
מיקרוסקופ סטריאוסקופי (לטיפול ברקמות)	אולימפוס	SZ61
מיקרוסקופ סטריאוסקופי (עבור איור 1B)	לייקה מיקרוסיסטמס	M165FC
מיקרוסקופ פלואורסצנטי (עבור איור 3)	ניקון	E800
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי	זיס	LSM700