טכניקת In Vivo למעקב אחר סחר בתאי T המושרה על ידי נוגדנים דו-ספציפיים לגידולים

תקציר

מקור: Espinosa-Cotton, M., et al. מעקב אחר סחר בתאי T המושרה על ידי נוגדנים דו-ספציפיים באמצעות תאי T אנושיים מותמרים של לוציפראז. J. Vis. Exp. (2023).

סרטון זה מדגים שיטה למעקב אחר סחר תאי T המושרה על ידי נוגדנים דו-ספציפיים לגידולים במודל עכבר. תאי T משפיעים של לוציפראז מוזרקים לעכבר עם קסנוגרפט של תא גידול תת עורי. לאחר מכן מוחדרים נוגדנים דו-ספציפיים, הנקשרים לתאי T ולתאי הגידול. מעקב אחר לוקליזציה של תאי T מתבצע באמצעות הדמיה ביולומינסנטית, כאשר עוצמת האות מציינת את מידת החדירה של תאי T לתוך הגידול.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. טרנספקציה של תאי 293T עם לוציפראז וקציר של supernatant ויראלי

1. תרבית של 293T תאים
   1. הכן מדיה על ידי הוספת הדברים הבאים לליטר של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) כל אחד: 110 מ"ל של סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS), 11 מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין.
   2. הפשיר 5 x 10^{6 293T} תאים ולהעביר אותם לתוך בקבוק T175 עם מדיה מוכן כמתואר לעיל.
   3. פצל את תאי 293T 1:10 כל 3 ימים למשך 6 ימים. אל תאפשר לתאים להיות יותר מ 90% confluent.
2. טרנספקציה של תאי 293T
   הערה: הכמויות הבאות של ריאגנטים מחושבות עבור transfecting בקבוק T175 אחד של 293T תאים. התאימו בהתאם אם רוצים להמיר צלוחיות נוספות.
   1. העבר 1.5 מ"ל של מדיה לכל אחד משני צינורות 50 מ"ל באמצעות פיפטה. לצינור אחד, הוסיפו 10 מיקרוגרם של פלסמיד VSV-G, 20 מיקרוגרם של Gag/pol ו-20 מיקרוגרם של פלסמיד לוציפראז עגבניות TD אדומות של חיפושית קליק (CBR-TDR) וערבבו. לצינור השני, להוסיף 100 μL של DNA מגיב transfection חוץ גופית ולערבב. יש לדגור על שני הצינורות בטמפרטורת החדר (RT) למשך 5 דקות
      הערה: כל הפלסמידים המתוארים בכתב יד זה סופקו על ידי ד"ר ולדימיר פונומרב.
   2. מעבירים את המדיה המכילה את מגיב הטרנספקציה של הדנ"א במבחנה טיפתית לצינור המכיל את פלסמידים של הדנ"א (מעל 30 שניות בקירוב) ומערבבים בעדינות עם פיפטה. יש לדגור ב-RT במשך 20 דקות.
   3. במהלך דגירה זו של 20 דקות, נתקו את תאי 293T על ידי הוספת 5-10 מ"ל של 0.05% טריפסין. לאחר ניתוק התאים, הוסף 10 מ"ל של מדיה וצנטריפוגה ב 800 x גרם למשך 5 דקות. להשעות את התאים ב 1.5 מ"ל של מדיה.
   4. הוסף את המדיה המכילה את מגיב הטרנספקציה במבחנה של ה- DNA ואת פלסמידים של ה- DNA לתאי 293T ודגור ב- 37 ° C למשך 30 דקות.
   5. מעבירים לבקבוק T175 ומוסיפים 18 מ"ל מדיה. לדגור ב 37 °C (77 °F) במשך הלילה.
   6. למחרת, בזהירות לשאוף את התקשורת עם פיפטה זכוכית מבלי לנתק את התאים. החלף עם 18 מ"ל של מדיה טרייה. יש לדגור ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה באינקובטור.
3. קצירת סופרנאטנט ויראלי
   1. הסר את supernatant ויראלי באמצעות פיפטה לשים על קרח. צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות כדי לגלול את התאים ואת הפסולת.
      הערה: אם גלולת התא גדולה, סביר להניח שהתאים שובשו מהבקבוק כאשר הסופרנאטנט הוסר. תאים אלה יכולים להיות מצופים שוב בקבוק חדש עם מדיה טרייה.
   2. סננו את הסופרנאטנט הנגיפי באמצעות מסנן של 0.22 מיקרומטר.
   3. השתמש supernatant ויראלי מיד. שמרו אותו על קרח או בטמפרטורה של 4°C למשך עד 24 שעות, או הקפיאו אותו בטמפרטורה של -80°C לאחסון לטווח ארוך.

2. הרחבה והתמרה של תאי T אנושיים פעילים עם לוציפראז

1. הפעלה של תאי T אנושיים במבחנה
   1. שטפו את החרוזים על ידי הוספת 10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) המכיל 0.1% אלבומין בסרום בקר (BSA) ו-2 מילימטר חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA) לצינור סטרילי של 15 מ"ל, הוספת חרוזים (חרוז אחד לכל שני תאי T), הנחת במדף מגנטים למשך 2 דקות ושאיבת PBS.
   2. הכינו חומרי הדפסה כמתואר בשלב 1.1.1, ולאחר מכן הוסיפו IL-2 לריכוז סופי של 30 IU/mL והוסיפו את החרוזים השטופים. צור 2.5 מ"ל של מדיה עבור כל שני מיליון תאי T שיופעלו.
   3. ספרו את תאי ה-T (שטוהרו או טוהרו בעבר, הוקפאו, הופשרו ונשטפו) באמצעות המוציטומטר וכתם כחול טריפאן. הוסף תאי T למדיה שהוכנה בשלב 2.1.2 והפוך בעדינות את הצינור כדי לערבב. תאי T יתרחבו לפחות פי 20 בהתאם למקור ולבריאות הכללית של התאים. קבע את מספר תאי T שיש להפעיל על ידי חישוב המספר הדרוש לטיפול בעכברים וחלוקה ב- 20. כאן, 20 x 10⁶ תאי T לכל עכבר שימשו על בסיס ניסויים ראשוניים.
   4. צלחת 2.5 מ"ל של מדיה המכילה שני מיליון תאי T, חרוזים, ו (interleukin 2) IL-2 בכל באר של צלחת תרבית רקמה 24 בארות. תרבית ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח 5% CO₂.
   5. בדוק את תאי T תחת מיקרוסקופ 20x כל יום במשך 3 הימים הבאים כדי לקבוע מתי להתמיר עם luciferase. התאים מוכנים כאשר הם מתקבצים יחד ומרוקנים את המדיה, והופכים אותה מאדומה/ורודה לכתומה בהירה.
2. הכנת צלחות רטרונקטין
   הערה: רטרונקטין משמש לציפוי הלוחות המשמשים בטרנסדוקציה מכיוון שהוא משפר את התמרה הגנים.
   1. הוסף 2 מ"ל של 20 מיקרוגרם / מ"ל רטרונקטין ב- PBS לבאר של צלחת 6 בארות לא מטופלת. יש לדגור במשך שעתיים ב-RT או שעה אחת ב-37°C. באר אחת מצופה רטרונקטין נדרשת לכל שני מיליון תאי T כדי לעבור טרנספורמציה.
   2. שאפו את הרטרונקטין מבלי לגרד את תחתית הצלחת.
   3. הוסף 3 מ"ל של 2% BSA ב- PBS (מסונן סטרילי) לכל באר בצלחת 6 הקידוחים. דגירה במשך 30 דקות ב- RT.
3. ספינוקולציה
   1. שאפו את ה-BSA מבלי לגרד את תחתית הצלחת.
   2. לשטוף את הבארות פעם אחת עם 3 מ"ל של PBS לכל באר. המשיכו או החליפו ב-PBS טרי והשאירו את הצלחת מכוסה ב-4°C למשך הלילה.
   3. הוסף 2 מ"ל של CBR-TDR luciferase viral supernatant (נאסף בשלב 1.3) לכל באר.
   4. צנטריפוגה ב-1,240 x גרם למשך 90 דקות ב-32°C.
4. התמרה
   1. ספור את תאי T.
   2. שאפו את הסופרנאטנט הוויראלי מבלי לגרד את תחתית הצלחת.
   3. צלחת שני מיליון תאי T לבאר ב 6 מ"ל של DMEM המכיל 30 IU / mL IL-2 אנושי.
   4. בדוק את תאי T מדי יום. תאי T מוכנים להרחבה כאשר הם כמעט נפגשים, בדרך כלל לאחר יומיים.
   5. כאשר התאים כמעט נפגשים, שטפו אותם בעדינות מתחתית הצלחת באמצעות פיפטה והעבירו כל באר לצלוחית T75 נפרדת. הוסף 9 מ"ל של מדיה עבור סך של 15 מ"ל של מדיה לכל בקבוק.
   6. למחרת, להוסיף עוד 15 מ"ל של מדיה. התאים צריכים להיות מוכנים להזרקה לעכברים יום לאחר תוספת זו של מדיה. אשר התמרה מוצלחת על ידי ביצוע ציטומטריית זרימה (מבנה הלוציפראז מכיל פלואורופור עגבניות TD הנראה בערוץ PE).

3. השתלת תאי T מומרים לוציפראז בעכברים מדוכאי חיסון

1. הכינו וספרו את תאי ה-T להזרקה.
   1. הסר את תאי T מהצלוחיות וספור. התאים מוכנים להזרקה כאשר הם התרחבו פי 20-30, בדרך כלל ביום השביעי לאחר ההפעלה.
   2. צנטריפוגה את תאי T ב 800 x גרם במשך 5 דקות. Resuspend ב 2 מ"ל של מדיה ולהסיר את החרוזים באמצעות מתלה מגנט.
   3. בניסויים שבהם תאי T יוזרקו בנפרד מנוגדנים דו-ספציפיים, ספרו את תאי ה-T והשהו מחדש כך שהריכוז הסופי יהיה 20 מיליון תאי T לכל 100 מיקרוליטר מדיה. דלג לשלב 3.2. עבור ניסויים באמצעות תאי T חמושים ex vivo (EATs), דלג לשלב 3.1.4.
   4. עבור ניסויים המשתמשים בתאי T חמושים ex vivo, ספרו את תאי ה-T והפרידו אותם לצינורות נפרדים של 1.5 מ"ל עבור כל קבוצה, עם 20 מיליון תאים לכל עכבר. לדוגמה, אם יש שלוש קבוצות של חמישה עכברים כל אחת, להכין שלוש צינורות 1.5 מ"ל עם 100 מיליון תאי T כל אחד.
   5. צנטריפוגה את צינורות 1.5 מ"ל ב 800 x גרם במשך 5 דקות. הסר את המדיה בזהירות מבלי להפריע לגלולת תא T. יש להשהות מחדש בלא יותר מ-50 מיקרוליטר של מדיה המכילה את הנוגדנים הדו-ספציפיים. יש לדגור ב-RT למשך 30 דקות< בר/> הערה: לצורך ניסויים שנערכו במחקר זה, נעשה שימוש בנוגדנים דו-ספציפיים קנייניים מסוג IgG-[L]-scFv T העוסקים בתאי T שנוצרו במעבדה. לחימוש תאי T, יש להשתמש ב-5 מיקרוגרם נוגדנים לכל 20 x 10⁶ תאי T. ניתן להשתמש גם בנוגדנים דו-ספציפיים הזמינים מסחרית.
   6. שטפו נוגדנים עודפים על ידי הוספת 1,450 מיקרוליטר של מדיה לכל צינור. צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות, בזהירות לשאוף את התקשורת, ולהשהות מחדש בריכוז של 20 מיליון תאי T חמושים לכל 100 μL מדיה.
2. הזרקה והשתלה לעכברים
   1. מרדימים את העכברים בתא המספק איזופלורן בשאיפה של 3.5% (v/v) בחמצן 1 ליטר/דקה. העכברים מורדמים לחלוטין כאשר רפלקס הנסיגה של דוושת הגפה האחורית נעלם.
      הערה: ספק תמיכה תרמית לאורך כל ההליך.
   2. באמצעות מחט 26 G, להזריק 20 מיליון תאי T ב 100 μL של מדיה רטרואורביטלית לכל עכבר.
   3. מתן 1,000 U רקומביננטי IL-2 תת עורית לתמיכה בהישרדות תאי T in vivo.
   4. יש לתת את הנוגדנים הדו-ספציפיים באופן רטרואורביטלי (לתוך העין שאינה משמשת להזרקת תאי T) או תוך צפקית. לאפשר לעכברים להתאושש מההרדמה ולחזור לכלובים שלהם.
      הערה: שוב, כאן, נעשה שימוש בנוגדנים קנייניים שנוצרו במעבדה, אך ניתן להשתמש בנוגדנים זמינים מסחרית במקום. בניסויים כאן ניתנו 0.3-10 מק"ג נוגדנים לעכבר למנה. הנוגדנים ניתנו פעמיים בשבוע במשך 3-4 שבועות.

4. הדמיה In vivo של עכברים שהושתלו בהם תאי T מותמרים של לוציפראז

הערה: שלב זה יבוצע ביום ההדמיה, שאינו בהכרח אותו יום שבו תאי T ו/או נוגדנים ניתנים לעכברים. בדרך כלל, אנו מבצעים הדמיה 24 שעות לאחר מתן תאי T מותמרים לוציפראז.

1. הכנת D-luciferin
   1. להמיס 1 גרם של D-luciferin ב 33.3 מ"ל של PBS סטרילי (ריכוז סופי: 30 מ"ג / מ"ל).
   2. Aliquot מומס D-luciferin לתוך 33 x 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge ולשמור על צינורות ב -20 ° C.
   3. ביום ההדמיה, להפשיר מספיק aliquots של 30 מ"ג / מ"ל D-luciferin עבור מספר בעלי החיים להיות תמונה. צינור אחד מספיק עבור 10 בעלי חיים.
      הערה: יש להקפיא מחדש את יתרת D-לוציפרין לאחר השימוש. D-luciferin יציב לפחות חמישה מחזורי הקפאה/הפשרה.
2. מתן D-luciferin לעכברים
   הערה: לפני מתן D-luciferin לעכברים, לפתוח את תוכנת הדמיה ולאתחל את המערכת. המצלמה עשויה להימשך מספר דקות כדי להתקרר, וזה צריך להיעשות לפני העכברים מוזרקים עם D-luciferin כדי להבטיח כי הדמיה יכולה להתרחש 5 דקות לאחר מתן המצע.
   1. יש להרדים עד חמישה עכברים בתא המספק איזופלורן בשאיפה של 3.5% (v/v) בחמצן של ליטר/דקה. העכברים מורדמים לחלוטין כאשר רפלקס הנסיגה של דוושת הגפה האחורית נעלם.
   2. לאחר שהעכברים מורדמים לחלוטין, יש לתת 100 מיקרוליטר של 30 מ"ג/מ"ל D-לוציפרין לעכבר (3 מ"ג לעכבר) על ידי הזרקה רטרואורביטלית עם מחט 26 גרם. דמיינו את קבוצת העכברים הזו לפני מתן D-luciferin לקבוצה הבאה. הניחו את קבוצת העכברים הבאה בתא האיזופלורן כדי להיות מורדמים בזמן שהקבוצה הקודמת נמצאת בתמונה.
3. הדמיה של תאי T מותמרים של לוציפראז
   1. העבירו את העכברים המורדמים לתא האטום לאור של מכשיר ההדמיה והמשיכו לתת איזופלורן 3% ב-0.5 ליטר/דקה. הניחו את העכברים על צידם כך שהאגף הנושא את הקסנוגרפט פונה כלפי מעלה לכיוון המצלמה. צלם קבוצה נוספת של תמונות עם העכברים במצב שכיבה כדי להעריך את נוכחות תאי T בריאות.
   2. בלוח הבקרה של הרכישה, בחר זוהר, תצלום ושכבת-על. הגדר את זמן החשיפה לאוטומטי, את האיגוד לבינוני ואת F/Stop ל- 1. רכוש תמונות. לאחר התמונה הראשונה, הגדירו את זמן החשיפה כך שיתאים לזמן שחושב אוטומטית לתמונה הראשונה, כך שניתן יהיה להשוות ישירות בין התמונות הבאות. כדאי לצלם תמונות עם זמני חשיפה מרובים כדי לקבוע את זמן החשיפה המיטבי להשגת האות הבהיר ביותר ללא רוויית פיקסלים.
   3. הוציאו את העכברים מהאיזופלורן, חזרו לכלובים שלהם והתבוננו עד שהם ערים ואמבולטוריים.
   4. חזור על השלבים משלב 4.2.1 עד שכל הקבוצות יצולמו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
293T תאים	ATCC	CRL-11268
BSA	סיגמא אולדריץ'	A7030-10G
CD3 / CD28 חרוזים	Gibco (ThermoFisher)	11161ד
D-לוציפרין, מלח אשלגן	גולדביו	מזל-1G
DMEM	Gibco (ThermoFisher)	11965092
מגיב טרנספקציה במבחנה DNA (polyjet)	מעבדות SignaGen	SL100688
EDTA	סיגמא אולדריץ'	E9884-100G
פ.ב.ס.	Gibco (ThermoFisher)	10437028
גאג/פול פלסמיד	אדג'ין	14887
פלסמיד GFP	אדג'ין	11150-DNA.cg
פניצילין-סטרפטומיצין	Gibco (ThermoFisher)	15140122
IL-2 אנושי רקומביננטי	מערכות מו"פ	202-IL-010/CF
רטרונקטין	טאקרה	T100B
טריפסין	Gibco (ThermoFisher)	25-300-120
פלסמיד VSV-G	אדג'ין	8454