$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. תרביות תאים וטפילים
- לגדל תאים LLC-MK2 (Rhesus Monkey Kidney Epithelial) מאוסף תרביות הסוג האמריקאי (CCL-7) בבקבוק תרביתתאים בגודל 25 ס"מ המכיל במכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) בינוני בתוספת FBS (סרום בקר עוברי בלתי פעיל בחום 10%) ואנטיביוטיקה (100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין) ב-37°C ב-5% פחמן דו-חמצני (CO2).
- להדביק תאים LLC-MK2 עם Trypanosoma cruzi (זן Y) על פי פרוטוקול קודם.
- אסוף את הסופרנאטנט של התאים הנגועים LLC-MK2 (5 מ"ל) בצינור צנטריפוגה חרוטי תרבית תאים של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 500 x גרם למשך 10 דקות ו -22 ° C כדי להוריד פסולת תאים. שמור את הצינור במשך 10 דקות ב 37 ° C כדי לאפשר trypomastigotes לשחות אל supernatant.
- אספו את הסופרנאטנט בצינור חרוטי חדש ובצנטריפוגה במהירות 2500 x גרם למשך 15 דקות ב-22°C. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה המכילה את הטפילים בתווך סל"ד שלם כדי לקבוע את צפיפות התאים על ידי ספירת תאים בתא נויבאואר.
2. פרוטוקול בקרה immunofluorescence
הערה: לאחר התיקון, ניתן לאחסן צלחות המכילות כיסויים ב 4 ° C ב 1x מלוחים חוצצים פוספט (PBS) (pH 7.2) במשך שבוע אחד. כדי להיות מאוחסן, חשוב כי התאים לא עברו את שלב permeabilization.
- יש למקם תאי LLC-MK2 (2 x 104) ב-24 צלחות באר המכילות כיסויים מעוגלים מעוקרים אולטרה סגולים (UV) במדיית RPMI למשך 16 שעות.
- עבור תאים נגועים, להוסיף supernatant המכיל T. cruzi (פריט 1.4) לכל באר בפרופורציה (ריבוי של זיהום, MOI 10: 1) ולהשאיר 6 שעות של זיהום. יש לכבס כיסויים המכילים תאים נגועים ולא נגועים חמש פעמים בתמיסת PBS ומקובעים עם 2% פרפורמלדהיד ב-1x PBS (pH 7.2) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- שטפו את הכיסויים שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחת עם 1x PBS (pH 7.2).
- חדרו את הכיסויים עם 0.2% IGEPAL CA-630 (octylphenoxypolyethoxyethanol) ב-1x PBS (PH 7.2) למשך 10 דקות ב-RT.
- שטפו את הכיסויים שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחת עם 1x PBS.
- דגרו על כיסויים למשך 30 דקות ב-RT עם פתרון החסימה (אלבומין בסרום בקר 2%, BSA ב-1x PBS, pH 7.2).
- יש לדגור על כיסויים למשך 30 דקות ב-RT עם נוגדנים חד-שבטיים של עכבר anti-hnRNPA1 (anti-heterogeneous ribonucleoprotein-A1) (דילול 1:200) או עם נוגדנים רב-שבטיים נגד TcFAZ (anti-Trypanosoma cruzi flagellum attachment zone protein) (דילול 1:100) המדוללים בתמיסה חוסמת.
- שטפו את הכיסויים שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחת עם 1x PBS.
- יש לדגור על הכיסויים למשך 30 דקות ב-RT עם IgG F (ab')2 (H+L) נגד עכבר עז מצומד ל-Alexa Fluor 488 (1:600) יחד עם פלואידין מצומד ל-Alexa 594 (1:300) כדי להכתים חוטי אקטין (F-actin) בתא המארח המדולל בתמיסת החסימה.
- יש לשטוף שלוש פעמים עם 1x PBS (pH 7.2) במשך 5 דקות כל אחת.
- יש למרוח כמות קטנה של מגיב הרכבה נגד דהייה ProLong Gold עם מדיום 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) על פני השטח של השקופית.
- בעזרת מלקחיים, הטו בעדינות את הכיסוי באמצעי ההרכבה כדי למנוע היווצרות בועות. לאחר הייבוש, אטמו את הכיסוי במידת הצורך.
3. פרוטוקול אימונופלואורסנציה של תיוג כפול באמצעות נוגדנים חד-שבטיים ורב-שבטיים שגודלו באותו פונדקאי
- חזור על שלבים 2.1 עד 2.6 המתוארים לעיל.
- דגירה על כיסויים המכילים תאים נגועים ולא נגועים עם נוגדן רב-שבטי אנטי-TcFAZ של עכבר פנימי (1:100) מדולל בתמיסת חסימה למשך 30 דקות ב-RT.
- שטפו את הכיסויים שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחת עם 1x PBS.
- דגרו על כיסויים למשך 30 דקות ב-RT עם IgG F (ab')2 (H+L) נגד עכבר עזים מצומד ל-Alexa Fluor 647 (1:600) מדולל בתמיסת החסימה.
- שטפו את הכיסויים שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחת עם 1x PBS.
- בצע את שלב החסימה השני עם AffiniPure rabbit נגד עכבר IgG (H+L) מדולל (0.12 מ"ג / מ"ל) בתמיסת חסימה למשך 30 דקות ב- RT.
- שטפו את הכיסויים שלוש פעמים עם 1x PBS (pH 7.2) במשך 5 דקות כל אחד. לאחר מכן יש לדגור עם נוגדן חד-שבטי נגד hnRNP A1 IgG2b של עכבר (1:200) למשך 30 דקות ב-RT.
- שטפו את הכיסויים שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחת עם 1x PBS.
- דגרו על הכיסויים במשך 30 דקות עם נוגדן IgG2b נגד עכבר עז מצומד ל-Alexa Fluor 488 (1:600) ועם פלואידין מצומד ל-Alexa 594 (1:300) מדולל בתמיסת החסימה.
- שטפו את הכיסויים שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחת עם 1x PBS.
- חזור על שלבים 2.8 עד 2.10 המתוארים לעיל.