טכניקת כרומטוגרפיית זיקה לטיהור נוגדנים חד-שבטיים

תקציר

מקור: Elgundi, Z., et al. ייצור בקנה מידה מעבדה וטיהור של נוגדן טיפולי. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מדגים טכניקה לטיהור נוגדנים חד-שבטיים מתרבית תרבית המתקבלת מתרבית תאים המייצרת נוגדנים. התהליך כולל שימוש במטריצה של חרוזי אגרוז מוצלבים עם חלבון A מצומד, אשר משתק את הנוגדנים בסופרנאטנט שעל החרוזים, ומאפשר הפרדה יעילה ממזהמים. על ידי החלת חיץ אלוציה עם pH נמוך, האינטראקציה בין חלבון לנוגדן A מתרופפת, מה שמקל על איסוף שברים המכילים נוגדנים.

פרוטוקול

1. טיהור נוגדנים על ידי כרומטוגרפיית זיקה באמצעות מערכת אוטומטית של כרומטוגרפיה נוזלית של חלבון מהיר (FPLC)

הערה: בדרך כלל ניתן להחיל את ההליך הבא על רוב המערכות האוטומטיות. טיהור יכול להתבצע בטמפרטורת החדר או ב 4 ° C (אם מערכת FPLC נשמרת בחדר קריר). ניתן לבצע סדרה של בדיקות סקאוטינג כדי לזהות את תנאי הטיהור האופטימליים כולל מטריצת עמודות מתאימה, מאגר קשירה, חיץ אלוציה ו- pH כדי להבטיח התאוששות מקסימלית של נוגדנים מטוהרים ממדיה מותנית (עיין בסעיף תוצאות). התנאים האופטימליים תלויים בנוגדן או בחלבון המטוהרים. הטיהורים בוצעו על מערכת FPLC אוטומטית. הטיהורים בוצעו בטמפרטורת החדר באמצעות עמודת חלבון A של 5 מ"ל.

1. הכן את המאגרים הבאים באמצעות מים טהורים במיוחד והתאם ל- pH המומלץ, ולאחר מכן סנן דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר.
   1. הכן 1 ליטר של מלח חוצץ פוספט (PBS) pH 7.4 (חיץ קשירה) על ידי ערבוב הדברים הבאים: 0.14 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.01 M Na₂HPO₄ ו- 0.001 M KH₂PO₄. התאם את רמת החומציות במידת הצורך לפני סינון המאגר.
   2. הכינו 500 מ"ל של 0.1 M גליצין-HCl pH 2.7 (חיץ אלוציה). התאם את רמת החומציות לפני סינון המאגר.
   3. להכין 50 מ"ל של 1 M Tris pH 9.0 (חיץ נטרול).
2. ודא שכל חיבורי החשמל והתקשורת של המערכת עם המחשב מתבצעים. התקנים צריכים להיות גלויים במודול 'בקרת מערכת' של התוכנה. ודא שתא UV מוגדר באורך גל של 280 ננומטר. אופציונלי: כיול מד החומציות אם הוא מחובר ויש להשתמש בו.
3. טבלו צינורות כניסה של A, B ודגמו משאבה במים טהורים במיוחד כדי לשטוף את המערכת. לטהר את המשאבות עם מזרק אם יש אוויר בצנרת או חשד לאוויר במערכת. יש לשטוף את המערכת במים בהפעלה ידנית באמצעות בקר המערכת או בשיטה אוטומטית. שים לב כי לחץ, מוליכות, מעקב UV280 ו- pH נשארים עקביים וכי מגבלת הלחץ עבור העמודה אינה חורגת בהתאם למפרט היצרן.
   הערה: חריגות עשויות להצביע על אוויר או חסימה במערכת שיש לטפל בהם לפני שתמשיך.
4. במודול בקר המערכת, התחל את קצב הזרימה ב- 1 מ"ל/דקה באופן ידני באמצעות משאבה A במצב עומס (עקיפת לולאת דגימה) או הזרקה (דרך לולאת הדגימה) כדי להתחיל לחבר את העמודה. נתק את צינורות המערכת בכניסת מיקום העמודה והסר את הפקק המחובר לכניסת העמודה.
   1. אפשרו למים לזרום מצינור המערכת בטיפה על גבי העמוד, ולאחר מכן חברו את צינורות המערכת לעמודה. חיבור העמוד ופתח הכניסה גדוש בטיפות מים מבטיח חיבור נקי מבועות אוויר.
5. חבר את שקע העמודים בשקע במורד הזרם וודא שכל האביזרים מהודקים היטב. כאשר העמודה מחוברת כעת למערכת, אל תחרוג מהמגבלות עבור מגבלת לחץ מרבית וקצב זרימה כמתואר במפרט העמודה.
6. יש לשטוף עמוד עם 5 עמודי עמודים (CV) של מים. במידת הצורך, המשך בשטיפת העמודים עד להתייצבות מעקב UV280.
7. טבילת צינורות כניסה של A במאגר קשירה, B במאגר Elution ומשאבת דגימה במאגר קשירה כדי לאזן את המערכת במאגרים נכונים. מלא את צינורות הכניסה במאגר באמצעות PumpWash בהפעלה ידנית.
8. במודול 'עורך השיטות' של התוכנה, השתמש באשף השיטות כדי להגדיר שיטת כרומטוגרפיית זיקה עבור העמודה המיועדת לשימוש.
   הערה: מערכות FPLC אוטומטיות מגיעות עם שיטות הממולאות מראש בהגדרות המומלצות (כלומר קצב זרימה ומגבלת לחץ) ומפעילות שלבים המבוססים על העמודה (יצרן, מטריצה וגודל) שנבחרה לטיהור.
   1. השתמש בשלבי ההפעלה הבאים עבור כרומטוגרפיית זיקה של חלבון A:
      1. מערכת שיווי משקל עם 5 CV של חיץ מחייב ואיסוף זרימה למיכל פסולת.
      2. טען דגימה לעמודה (אמצעי אחסון לטעינה מצוין ידנית בשיטה) ואסוף זרימה למכל נפרד.
      3. מערכת שטיפה עם 5 CV של חיץ מחייב ואיסוף זרימה לתוך מיכל נפרד.
      4. עמוד לוט עם שבר איזוקרטי 5 CV באמצעות חיץ אלוציה ואיסוף דגימת נוגדנים מטוהרים כשברים על ידי אספן שברים.
      5. מערכת שיווי משקל עם 5 CV של חיץ מחייב ואיסוף זרימה למיכל פסולת.
9. לאחר הגדרת השיטה, ציין את אמצעי האחסון של המדיה המותנית שיוחל על העמודה ושמור את פעולת השירות.
   הערה: הנפח שצוין בשיטה צריך להיות 5-10 מ"ל פחות מהנפח בפועל כדי למנוע הכנסת אוויר במהלך ריצת הדגימה. הנפח שצוין המשמש בפרוטוקול זה הוא 90-120 מ"ל.
10. השקיעו את צינור משאבת הדגימה בכלי המכיל את המדיה המותנית.
11. הכן מיכל נפרד לאיסוף זרימת דגימה דרך צינורות היציאה שצוינו.
    הערה: חשוב לאסוף את הזרימה במקרה שמתרחשת שגיאה במהלך ההפעלה או חריגה מקיבולת האיגוד של העמודה, מה שמחייב להחיל מחדש את הזרימה על העמודה או לחזור על הטיהור.
12. הכינו צינורות איסוף באוסף השברים. הוסף 100 μl של חיץ נטרול לכל נפח שבר של 1 מ"ל. מערכת FPLC תנפטר באופן אוטומטי את השברים לתוך צינורות האיסוף.
13. במודול 'בקרת מערכת' של התוכנה, פתח את השיטה להפעלה.
    הערה: הפעלת השיטה מופעלת בסדרת דפים הכוללת בדיקת משתני השיטה, הגדרת אספן השברים והגדרת שם קובץ התוצאה ומיקום האחסון.
14. לחץ על התחל כדי להתחיל את ההפעלה. ניתן לנטר את הריצה במודול 'בקרת מערכת'.
15. בסיום ריצת הטיהור, בדוק את הכרומטוגרמה המתקבלת במודול 'הערכה' בתוכנת המערכת.
16. שלב את כל השברים המכילים חלבון לצינור נפרד, החלפת חיץ ורכז ב- PBS באמצעות התקן מסנן צנטריפוגלי עם חיתוך משקל מולקולרי של 30 kDa. בצע שלבי צנטריפוגה בהתאם להוראות היצרן.
17. יש למדוד את ריכוז הנוגדנים באמצעות בדיקת חומצה ביכומונית (BCA) בהתאם להוראות היצרן.
18. אם יש לבצע ריצת טיהור נוספת, העלו את צינור המשאבה לדוגמה במאגר קשירה וחזרו על שלבים 1.9-1.14.
19. בסיום ריצות הטיהור, לטבול צינורות כניסה של A, B ולדגום משאבה במים טהורים במיוחד ולשטוף את המערכת ואת העמודה כפי שבוצע בשלב 3.
20. יש לטבול את צינורות המשאבה A, B ולדגום באתנול 20% ולבצע שטיפה חוזרת לאחסון המערכת והעמודה.
21. נתק את העמודה מהשקע במורד הזרם והחלף את פקק העמודה, ולאחר מכן נתק את העמודה בכניסה והחלף פקק, חבר מחדש צינורות למערכת. אחסן את העמודה ב- 4 °C.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
טבליות מלח חוצץ פוספט (PBS), pH 7.4, 100 מ"ל	09-2051-100	אסטרל סיינטיפיק
HiTrap חלבון A בעל ביצועים גבוהים, 1 x 5 מ"ל עמודה	GE17-0403-01	סיגמא-אולדריץ'
AKTAמטהר 100	28406266	GE שירותי בריאות	מערכת FPLC אוטומטית, שיכולה לכלול משאבת מדגם P-960 ואספן שברים Frac-920.
גליצין-הידרוכלוריד	G2879	סיגמא-אולדריץ'
חומצת לימון, מונוהידראט	BIOC2123	אסטרל סיינטיפיק
נתרן ציטראט, טריסודיום מלח דיהידראט	BIOCB0035	אסטרל סיינטיפיק
1 M Tris-HCl פתרון pH 9.0	BIOSD8146	אסטרל סיינטיפיק
Amicon אולטרה צנטריפוגלי מסננים (30 MWCO)	UFC803008/UFC903008	מרק מיליפור	משמש כדי לאגור חילופי ולרכז חלבון מטוהר.
ערכת בדיקה של חומצה ביצינכונינית (BCA) פירס	23227	תרמו פישר סיינטיפיק
מערכת BLItz	45-5000	fortéBIO	מכשיר המשמש למדידות אינטרפרומטריה של שכבה ביולוגית (BLI).
חיישנים ביולוגיים של חלבון A	18-5010	fortéBIO