טכניקת צביעה אימונופלואורסצנטית לזיהוי נוירוגנזה של היפוקמפוס בוגר

תקציר

מקור: Ansorg, A., et al. Immunohistochemistry and multiple Labeling with Antibodies from the Same Species Host to Study Adult Hippocampal neurogenesis. J. Vis. Exp. (2015)

הסרטון מדגים שיטת צביעה אימונופלואורסצנטית המשמשת לבחינת נוירוגנזה בהיפוקמפוס הבוגר. בתחילה, אזור מוח עכבר עובר טיפול בנוגדנים ראשוניים המכוונים לחלבוני סמן הקשורים לנוירוגנזה בתאי אב עצביים. לאחר מכן, הוא מסומן עם נוגדנים משניים מתויגים עם fluorophores. לאחר מכן נצפה קטע המוח תחת מיקרוסקופ קונפוקלי כדי להבחין בין תת-סוגים שונים של תאי אב, בהתבסס על דפוסי הביטוי של שילובים שונים של חלבוני סמן.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת רקמות

1. הכינו 4% פורמלדהיד ב-0.1 M פוספט buffer pH 7.4 ביום שלפני הזילוח. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
יש
2. לנקב את העכברים המורדמים עמוקות (3.5% איזופלורן) דרך החדר השמאלי עם 10 מ"ל מלח חוצץ פוספט קר כקרח (PBS), ולאחר מכן עם 40 מ"ל פורמלדהיד קר כקרח (קצב זרימה 5 מ"ל/דקה). יש לנתח את המוח ולבצע לאחר התיקון באותו קיבוע למשך 24 שעות בטמפרטורה של 4°C.
3. העבירו את המוח ברצף ל-10% (24 שעות ב-4°C) ול-30% סוכרוז (עד שהמוח שוקע, כ-48 שעות). להקפאה, השקיעו באיטיות את המוח המוגן בהקפאה לתוך איזופנטאן של -25 מעלות צלזיוס עד שלא יצאו בועות מהרקמה. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C.
4. חתכו חתכים בעובי 40 מיקרומטר על מיקרוטום מקפיא (טמפרטורת בלוק ב -25 עד -16 ° C). העבירו ברצף מקטעים לתמיסה נוגדת הקפאה המכילה בארות של צלחת תרבית תאים בת 24 בארות (ראו איור 1). יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C.

2. Immunostaining

הערה: החלקים מעובדים בציפה חופשית, בדרך כלל בצלחות בנות 6 בארות המצוידות בלוח נשא ותוספות רשת. כיוצא מן הכלל, חסימה, דגירות נוגדנים ותגובות קומפלקס אבידין-ביוטין (ABC) נעשות בצלחות של 12 או 24 בארות ללא תוספות רשת (0.5 עד 1 מ"ל לכל באר מספיק, בהתאם למספר הפרוסות שיש להכתים). במהלך שלבים אלה, להעביר חלקים בעזרת מברשת עדינה (לשטוף עם כל פתרון חדש). כל הדגירות נעשות עם תסיסה מתמשכת (מקסימום 150 סל"ד).

1. אימונוהיסטוכימיה (שיטת ABC)
   1. מעבירים מקטעים מנוגדי הקפאה למלח חוצץ תריס (TBS) ושוטפים ביסודיות (פעם O/N ב-4°C, 5 פעמים בטמפרטורת החדר [RT] במשך 10 דקות כל אחד) כדי להסיר לחלוטין את נוזל ההקפאה.
   2. כדי להרוות את פעילות הפרוקסידז האנדוגני, יש לדגור במשך 30 דקות ב-1.5% H₂O₂ ב-TBS-Tween 20 (TBS-T). שימו לב לחלקים מבעבעים ושוקעים מחדש במידת הצורך. יש לשטוף 3 פעמים ב-TBS במשך 15 דקות כל אחת.
   3. אופציונלי: בינתיים, חממו מראש ארון חימום ו-2 N HCl עד 37°C. כדי לנטרל דנ"א, יש לדגור על מקטעים במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C ב-2N HCl. להפריד בעדינות בין מקטעים בעזרת מברשת.
   4. אופציונלי: נטרל מקטעים למשך 10 דקות ב-0.1 מ' בוראט חוצץ pH 8.5, RT. בזמן ההעברה, יש לספוג לזמן קצר את תוספות הרשת המכילות את החלקים על מגבת נייר כדי להסיר את השאריות של HCl. יש לשטוף פעמיים ב-TBS במשך 15 דקות כל אחת.
   5. יש לדגור ב-TBSplus כדי לחדור לרקמה ולחסום אתרי קשירת נוגדנים לא ספציפיים למשך שעה אחת ב-RT.
   6. יש לדגור בנוגדן ראשוני מדולל ב-TBSplus, O/N ב-4°C. יש לשטוף 3 פעמים ב-TBS במשך 15 דקות כל אחת.
   7. יש לדגור בנוגדן משני ביוטינילציה מדולל ב-TBSplus למשך 3 שעות ב-RT. יש לשטוף 3 פעמים ב-TBS במשך 15 דקות כל אחת. בינתיים...
   8. הכן קומפלקס ABC על פי פרוטוקול היצרן (1% A + 1% B ב- TBS-T). יש לאפשר עמידה של 30 דקות ב-RT לפני השימוש. יש לדגור על חלקים בריאגנט AB למשך שעה אחת ב-RT. יש לשטוף 3 פעמים ב-TBS במשך 15 דקות כל אחת.
   9. הכינו 50 מ"ל 0.5 מ"ג/מ"ל 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) ב-TBS-T לצלחת של 6 או 12 בארות, מפוצלים לשני חצאים, ופיפטה 4 מ"ל או 2 מ"ל לבאר, בהתאמה. העבר מקטעים לתמיסת DAB (זהירות! DAB הוא רעיל. בצע את MSDS הספציפי שסופק על ידי הספק, כלומר, ללבוש מעיל מעבדה וכפפות ולהשתמש מכסה אדים כימי).
   10. הוסף 0.5 מ"ל 1% H₂O₂ לתמיסת DAB הנותרת של 25 מ"ל, ערבב ונפחים שווי ערך פיפטה כמפורט לעיל לכל באר כדי להתחיל את תגובת הפרוקסידז. דוגרים במשך 12 דקות. יש לשטוף 3 פעמים ב-TBS במשך 15 דקות כל אחת.
   11. הרכבה של מקטעים לשקופיות בג'לטין וייבוש באוויר O/N. כיסוי עם אמצעי הרכבה קבוע.
   12. אופציונלי: כתם נגדי לפני הנחת הכיסוי.
       הערה: אם יחס האות לרעש נמוך בגלל הרקע הגבוה, חזור על הטיפול H₂O₂ לאחר הדגירה עם מגיב AB (שלב 2.1.8).
2. מולטיפל-אימונופלואורסנציה
   1. אימונופלואורסנציה מרובה יחידה או בו זמנית
      1. מעבירים חלקים מנוגדי הקפאה לתוך TBS ושוטפים היטב (פעם O/N ב-4°C, 5 פעמים ב-RT למשך 10 דקות כל אחד) כדי להסיר את נוזל ההקפאה לחלוטין.
      2. אופציונלי: כשלבים 2.1.3 - 2.1.4.
      3. דגירה ב-TBSplus כדי לחדור לרקמה ולחסום אתרי קשירת נוגדנים לא ספציפיים, שעה אחת ב-RT.
      4. יש לדגור בקוקטייל נוגדנים ראשוני (למשל, α-BrdU (ברומודוקסיורידין), שרקן α-DCX (דו-קורטין), עיזים α-GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק)) מדולל ב-TBSplus, O/N ב-4°C. יש לשטוף 3 פעמים ב-TBS במשך 15 דקות כל אחת.
      5. יש לדגור בקוקטייל של נוגדנים משניים מצומדים פלואורוכרום (למשל, Rhodamine Red α-rat, Alexa-647 α-שרקן, Alexa-488 α-עז; כולם נגזרים בחמור) מדוללים ב-TBSplus, 3 שעות ב-RT או O/N ב-4°C. מעתה ואילך להגן על חלקים מפני אור. יש לשטוף 3 פעמים ב-TBS במשך 15 דקות כל אחת.
      6. הרכיבו מקטעים למגלשות בג'לטין וייבשו באוויר למשך הלילה (O/N). כיסוי עם אמצעי הרכבה מימי.
   2. אימונופלואורסנציה מרובה רציפה עם נוגדנים ראשוניים מאותו מין מארח
      1. כשלבים 2.2.1.1 - 2.2.1.3.
      2. יש לדגור בנוגדן ראשוני ראשון (למשל, ארנב α-אנטיגן A), O/N ב-4°C. יש לשטוף 3 פעמים ב-TBS ופעם אחת ב-TBS-T במשך 10 דקות כל אחת.
      3. דגירה בנוגדן משני מצומד פלואורוכרום ראשון (למשל, רודאמין אדום-קונג'. חמור α-ארנב), 3 שעות RT. מעתה, הגן על חלקים מפני אור. יש לשטוף 3 פעמים ב-TBS ופעם אחת ב-TBS-T במשך 10 דקות כל אחת.
      4. יש לדגור בסרום תקין של 10% מאותו פונדקאי כמו הנוגדנים הראשוניים (למשל, נסיוב ארנבים) למשך 3 שעות RT כדי להרוות פרטופים פתוחים על הנוגדן המשני הראשון. יש לשטוף 3 פעמים ב-TBS ופעם אחת ב-TBS-T במשך 10 דקות כל אחת.
      5. דגרו ב-TBSplus עם 50 מיקרוגרם/מ"ל מקטעי Fab חד-ערכיים לא מצומדים המכוונים נגד המארח של הנוגדנים הראשוניים (למשל, α-ארנב IgG (H+L)) כדי לכסות אפיטופים שניתן לזהות על ידי הנוגדן המשני השני, O/N ב-4°C.
      6. יש לשטוף לפחות 3 פעמים ב-TBS ופעם אחת ב-TBS-T במשך 10 דקות כל אחת. תוך כדי העברה, מקלחים לזמן קצר את תוספות הרשת המכילות את החלקים על מגבת נייר כדי להסיר את השאריות של Fab.
      7. יש לדגור בנוגדן ראשוני שני (למשל, ארנב α-אנטיגן B), O/N ב-4°C. יש לשטוף 3 פעמים ב-TBS ופעם אחת ב-TBS-T במשך 10 דקות כל אחת.
      8. יש לדגור בנוגדן משני מצומד פלואורוכרום שני (למשל, Alexa-488-conj. חמור α-ארנב), 3 שעות RT. יש לשטוף 3 פעמים ב-TBS במשך 15 דקות כל אחת, להרכיב ולכסות כמפורט לעיל.
         הערה: כדי לתייג אנטיגנים עם נוגדנים ממינים מארחים שונים, הוסף אותם לשלב 2.2.2.2 ואת הנוגדנים המשניים המתאימים לשלב 2.2.2.3.

תוצאות

איור 1. המחשה סכמטית של העברת פרוסות מיקרוטום לצלחת בת 24 בארות. התחל ב- A1 ומקם את הפרוסות הבאות בשורה A; אחרי A6, עבור לשורה הבאה B, וכן הלאה. כשתגיעו ל-D6, חזרו ל-A1 והמשיכו הלאה. סידור פרוסות זה מאפשר לכמת^{כל n} מקטע של מוח שלם. לכימות של תאי יילוד, קח כל קטע מוח⁶ (שווה ערך לתוכן של עמודה אחת); עבור פנוטיפ immunofluorescence, לקחת כל קטע¹² (שווה ערך לתוכן של 2 שורות...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
הכנת רקמות
איזופלורן-אקטביס	Piramal שירותי בריאות	700211
אבקת פרפורמאלדהיד (PFA)	רידל-דה האן	16005	רעיל, דליק
משאבת זילוח PD5206	היידולף אינסטרומנטס	523-52060-00
צינורות מעבדה Masterflex Tygon, Ø 0.8 מ"מ	תרמו פישר סיינטיפיק	06409-13
מחט האכלה, ישר, 21 גרם, 1.75 מ"מ קצה זית, 40 מ"מ	אגנתוס	1036
מיקרוטום הקפאה Microm HM 400	תרמו פישר סיינטיפיק
צלחות מרובות בארות תרבית תאים 24 בארות	גריינר ביו-וואן	662160
אימונוהיסטוכימיה
Tefal vitacuisine ספינת קיטור	טפל	VS 4001
תוספות קרום רשת פוליאסטר 24 מ"מ Netwell	קורנינג	3479	טעון מראש בצלחות תרבית של 6 בארות
תוספות קרום רשת פוליאסטר 15 מ"מ Netwell	קורנינג	3477	טעון מראש בצלחות תרבית של 12 בארות
ערכת מנשא 6 בארות פלסטיק Netwell	קורנינג	3521	לתוספות קרום רשת פוליאסטר 24 מ"מ
ערכת נשיאה מפלסטיק Netwell 12-well	קורנינג	3520	לתוספות קרום רשת פוליאסטר 15 מ"מ
ערכת Vectastain Elite ABC	מעבדות וקטוריות	PK-6100
DAB (3,3′-דיאמינובנזידין טטרהידרוכלוריד הידרט)	סיגמא-אולדריץ'	D-5637	מסרטן, רגיש לאור
פלואורומאונט-G	סאות'רן ביוטק	0100-01
נוגדנים ראשוניים
ארנב IgG1 α-Ki67
ארנב α-GFAP, AS-3-GF	נובוקסטרה/ לייקה ביוסיסטמס	NCL-L-Ki67MM1	DAB 1:400/IF 1:100; דורש אחזור אפיטופ
עז IgG (H+L) α-GFP	מערכות סינפטיות	173 002	09:20
עכבר IgG1 α-nestin	נוגדנים Acris	₪1091P	06:00
שרקן IgG (H+L) α-Doublecortin	אבקאם	dorit_19999	1:200; דורש שליפת אפיטופ
חולדה IgG2a α-BrdU (מיימת)	מרק מיליפור	AB2253	09:20
חולדה IgG2a α-BrdU (מטוהר)	AbD Serotec/ Bio-Rad	OBT0030CX	לאיתור BrdU; DAB 1:500/IF 1:400
עכבר IgG1κ α-BrdU	AbD Serotec/ Bio-Rad	OBT0030	לאיתור CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400
עכבר IgG1 α-NeuN	BD Biosciences	347580	לאיתור IdU; DAB 1:500/IF 1:350
נוגדנים משניים	מרק מיליפור	MAB377	09:20
חמור α-שרקן IgG (H+L)-ביוטין
חמור α-חולדה IgG (H+L)-ביוטין	דיאנובה	711-065-152	09:20
חמור α-עכבר IgG (H+L)-ביוטין	דיאנובה	712-065-150	09:20
עז α-חולדה IgG (H+L)-Alexa Fluor 488	דיאנובה	715-065-151	09:20
חמור α-עז IgG (H+L)-Alexa Fluor 488	בדיקות מולקולריות	A11006	05:10
חמור α-עכבר IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment	בדיקות מולקולריות	A11055	05:10
חמור α עכבר IgG (H+L)-Alexa Fluor 647	דיאנובה	715-097-003	02:40
חמור α-שרקן IgG (H+L)-Alexa Fluor 647	דיאנובה	715-605-151	05:10
חמור α-חולדה IgG (H+L)-רודמין אדום-X	דיאנובה	706-605-148	05:10
חמור α-ארנב IgG (H+L)-רודמין אדום-X	דיאנובה	712-295-150	05:10
חמור α-שרקן IgG (H+L)-רודמין אדום-X	דיאנובה	711-295-152	05:10
סטרפטאבידין-רודאמין אדום-X	דיאנובה	706-296-148	05:10
ארנב α עיזים (H+L)-AMCA	דיאנובה	016-290-084	09:20
הוכסט 33342	דיאנובה	111-155-144	1:250, עובד רק עם ארנב α-GFAP
דאפי	בדיקות מולקולריות	H3570	17:40
חסימת	בדיקות מולקולריות	D1306	17:40
חמור פרגמנט פאב α עכבר IgG (H+L)
חמור פרגמנט פאב α-ארנב IgG (H+L)	דיאנובה	715-007-003	01:20
נסיוב חמורים רגיל	דיאנובה	711-007-003	01:20
סרום ארנב רגיל	מרק מיליפור	S30
סרום עיזים רגיל	דיאנובה	011-000-010
אלבומין בסרום בקר	דיאנובה	005-000-001
היסטולוגיה	סיגמא-אולדריץ'	A7906
סגול קרסיל
ניאו-קליר	סיגמא-אולדריץ'	C5042
ניאו-הר	מרק מיליפור	109843	תחליף קסילן לא רעיל
מיקרוסקופ	מרק מיליפור	109016	אמצעי הרכבה קבוע
אקסיוסקופ 2
LSM 710	קרל זיס מיקרוסקופיה
	קרל זיס מיקרוסקופיה