$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנת בעלי חיים
- מרדימים את העכברים באמצעות איזופלורן 3%. פתח את החזה על ידי ביצוע חתך אופקי באזור שמעל הבטן האמצעית ומשיכת העור. בזהירות לבצע חתך נוסף כדי לפתוח את חלל החזה מבלי לנקב איברים אחרים.
- יש לערבב את הלב דרך קודקוד תחילה ולאחר מכן דרך החדר הימני באמצעות 3% גלוטראלדהיד קר בתמיסה קרדיופלגית (50 mM KCl, 5% דקסטרוז ב- PBS, ראה טבלה 1) למשך 2 דקות כדי להבטיח הרפיה מלאה של שריר הלב.
- יש לערבב את הלב באמצעות 3% גלוטראלדהיד קר כקרח ב-0.1 M של חיץ נתרן קקודילט (pH 7.4) למשך 2 דקות נוספות. באמצעות לחץ כוח הכבידה, השתמש במחט 25 G 5/8" כדי להחדיר את הקיבועים ללב. מיד לאחר שהלב מתחיל להתמלא בקיבוע, הרימו את קודקוד הלב וחתכו את כלי הדם שמתחתיו במרחק של 1-2 מ"מ מהלב כדי להקל על הלחץ ולאפשר לנוזלים להתנקז.
- נתחו את הלב, הסירו את האטריה והכניסו את החדרים ל-3% גלוטראלדהיד/0.1 M נתרן קקודי בצלחת פטרי. חתכו פרפר לאחר 30-60 דקות קיבוע והניחו אותו בכלי פטרי המכיל 3% גלוטראלדהיד/קקודילט (ראו טבלת חומרים). קוצצים את הלב באמצעות להב כירורגי בקוביות קטנות של 1 מ"מ3 בזמן שהוא בתמיסת גלוטראלדהיד/קקודילט.
- תקן/טבול את רקמת הלב המנותחת בתמיסת גלוטראלדהיד/קקודילט למשך 24 שעות ב-4°C.
2. עיבוד רקמת לב
- לאחר 24 שעות של קיבוע, לשטוף את הרקמות ב 0.1 מ 'של חיץ נתרן cacodylate במשך 20 דקות.
- הכן מאגר קקודילט 0.1 M לפי השלבים הבאים.
- כדי להכין מאגר נתרן קקודיל 0.1 M, הכינו מלאי של 1 M נתרן cacodylate buffer על ידי המסת נתרן cacodylate (21.4 גרם) ו 1% סידן כלורי תמיסת (3 מ"ל) ב 90 מ"ל של מים מזוקקים. נפח את התמיסה ל 100 מ"ל על ידי הוספת המים המזוקקים. מערבבים היטב את התמיסה ומשאירים אותה למשך הלילה כדי להמיס את המומס.
- לאחר מכן, לקחת 10 מ"ל של 1 M נתרן cacodylate תמיסת מלאי ולהוסיף אותו 80 מ"ל של מים מזוקקים. כוונן את ה- pH ל- 7.4 באמצעות HCl ונפח אותו עד 100 מ"ל על ידי הוספת מים מזוקקים.
- חזור על השטיפה במאגר נתרן קקודיל 0.1 M למשך 20 דקות נוספות. הסר את הרקמות ממאגר נתרן קקודילט וטבול אותן בתמיסת אוסמיום טטרוקסיד 2% למשך 4 שעות בטמפרטורת החדר. תהליך זה נקרא אוסמיקציה.
- הכינו תמיסת אוסמיום טטרוקסיד 2% לפי השלבים הבאים.
- להכנת תמיסת אוסמיום טטרוקסיד 2%, יש ליטול תמיסת אוסמיום טטרוקסיד 4%, 4 מ"ל (ראו טבלת חומרים), תמיסת ציר נתרן קקודיל 1 מ"ל (0.8 מ"ל) ומים מזוקקים (3.2 מ"ל) להכנת תמיסת 8 מ"ל בסך הכל.
הערה: כל התהליך הזה והצעדים מכאן והלאה חייבים להתבצע במכסה המנוע.
- לאחר התנודה, לטבול את הרקמות בתמיסת 2% נתרן אצטט למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- הכינו תמיסת נתרן אצטט 2% על ידי המסת 4 גרם נתרן אצטט ב-20 מ"ל מים מזוקקים.
- לאחר מכן, לטבול את הרקמות בתמיסת אורניל אצטט 2% למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- הכינו תמיסת אורניל אצטט 2% על ידי המסת 4 גרם של אורניל אצטט ב -20 מ"ל מים מזוקקים.
- לאחר צביעת אורניל אצטט, יש לייבש את הרקמות ברצף באמצעות האלכוהולים והאצטון המדורגים בסדר המוזכר בטבלה 2.
3. הטבעה של רקמת לב
- הטמע את הרקמות המיובשות בשרף אפוקסי בצמיגות נמוכה לפי השלבים הבאים.
- כדי לייצר שרף אפוקסי בצמיגות נמוכה, יש לערבב 10.24 מ"ל של מונומר אפוקסי דו-חמצני ויניל ציקלוהקסן, 6.74 מ"ל של אתר דיגליצידיל של פוליפרופילן גליקול (DER 732), ו-30.05 מ"ל של אנהידריד לא נוצצי (NSA) (ראו טבלת חומרים) בצינור של 50 מ"ל. ערבבו היטב את המתלים ביד במשך 2 דקות.
- הוסיפו 18 טיפות של מאיץ אפוקסי 2-dimethylaminoethanol (DMAE, ראו טבלת חומרים) וערבבו היטב את התרחיף כדי לערבב היטב את הרכיבים.
- לספוג את הרקמות שרף אפוקסי ברצף הבא של התערובת.
- החליפו את 100% אצטון בשרף 1:1: תרחיף אצטון וטבלו בו את הרקמות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- החליפו את שרף 1:1: תרחיף אצטון בשרף 6:1: תרחיף אצטון וטבלו בו את הרקמות במשך 3 שעות.
- לבסוף, החליפו את תרחיף האצטון ביחס 6:1 בתרחיף שרף 100% והשאירו את הרקמות שקועות בו למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
- הכניסו את הרקמות לשרף טרי בתבניות מיקרו 8 מ"מ (ראו טבלת חומרים) ורפאו את הרקמות המשובצות בטמפרטורה של 70°C למשך הלילה.
הערה: ודא כי השרף קשה אך לא שביר לאחר הריפוי.
4. חתך רקמות באמצעות אולטרה-מיקרוטום
- חתכו את קוביות השרף עם הרקמה לגודל של לא יותר מ-1 מ"מ לפני הרכבה על האולטרה-מיקרוטום (ראו טבלת חומרים). מניחים את התבנית בצורה מדויקת ככל האפשר בזרוע המקוטעת של האולטרה-מיקרוטום ומקדמים ידנית את תבנית הדגימה לכיוון סכין היהלום.
- חתכו את החלקים בעובי של 500 ננומטר (חצי מיקרון) עם סכין היסטו (ראו טבלת חומרים), ובעזרת כלי לולאת EM, הרימו אותם והניחו אותם על מגלשת זכוכית.
- הניחו את מגלשת הזכוכית על פלטה חמה לכתם כחול טולוידין כדי למצוא את אזור העניין.
- לאחר מציאת אזור העניין, השתמש בסכין Ultra 45° (ראה טבלת חומרים) כדי לייצר חתכים דקים במיוחד מזהב בהיר (100 ננומטר). הניחו חלקים דקים במיוחד אלה על הצד העמום של רשת נחושת של 200 רשת.
5. צביעת קטע לב דק במיוחד
- התחילו את הצביעה על ידי הסרת המסכה של האנטיגן באמצעות תמיסת תחריט, כלומר תמיסת מטא-פריודאט 5% נתרן.
- הכינו 500 μL של תמיסת 5% נתרן מטפריודט (ראו טבלת חומרים) במים מזוקקים.
הערה: יש להכין תמיסה טרייה לפני השימוש.
- שים 20 μL של תמיסת נתרן metaperiodate על סרט פרפין נקי. מניחים את הרשתות המיובשות לחלוטין עם קטעי רקמה על טיפת תמיסת התחריט.
הערה: הצד העמום של הרשת עם קטע הרקמה חייב לפנות לכיוון תמיסת התחריט.
- השאירו את רשת המקטע על התמיסה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- שטפו את קטע הרקמה החרוט על ידי הנחתו על טיפת מים מזוקקים למשך 60 שניות.
- חסום את שאריות אלדהידים על ידי הנחת רשתות המקטעים על טיפה של תמיסת גליצין 0.05 M למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. כתם את קצות הרשת על נייר סינון כדי להסיר את תמיסת הגליצין השיורית.
- הכן תמיסת גליצין 0.05 M (ראה טבלת חומרים) על ידי המסת 3.75 מ"ג גליצין ב 1 מ"ל של 1x PBS (pH 7.4).
- מקם את רשתות החתך ב 10-20 μL של פתרון חסימה למשך 25 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: הרכב תמיסה חוסמת: 2 μL של 1% סרום עיזים רגיל (NGS) + 20 μL של 1% BSA (ריכוז סופי: 10%) + 178 μL של 1x PBS (pH 7.4) כדי להפוך נפח סופי של 200 μL.
- כתמו את קצוות הרשת על נייר סינון והניחו את מקטע הרשת על מדלל נוגדנים לריכוך בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
- לדגור על קטעי הרשת עם נוגדן ראשוני (Sigmar1 במקרה זה, ראה טבלת חומרים; מדולל 1:10 בדילול נוגדנים) במשך שעה ו-30 דקות בתא לח
.
- מייבשים את הרשת ושוטפים את חלקי הרשת עם נוגדנים מדללים פעמיים למשך 5 דקות כל אחד.
- יש לדגור על חלקי הרשת עם נוגדן משני ביוטינילציה (במקרה זה, נוגדן משני רב-שבטי אנטי-ארנב אנטי-ארנב, ראו טבלת חומרים; דילול 1:10 בדילול נוגדנים) למשך שעה אחת בתא לח.
- מייבשים את הרשת ושוטפים את חלקי הרשת עם נוגדנים מדללים פעמיים למשך 5 דקות כל אחד.
- יש לדגור על קטעי הרשת ב-QD מצומד סטרפטווידין (QD655nm) הזמין מסחרית, ראו טבלת חומרים; דילול 1:10 בדילול נוגדנים) למשך שעה אחת בתא לח בטמפרטורת החדר. יש למנוע חשיפה לאור על ידי כיסוי התא ברדיד אלומיניום.
- ייבשו את קצוות הרשת באמצעות נייר סינון ושטפו את חלקי הרשת על ידי הנחתם על טיפות מים למשך 2 דקות.
- כתם את קצות הרשת לייבוש.
טבלה 1: הרכב PBS ותמיסות אחרות המשמשות להתייבשות רקמות.
| מאגר | הרכב | כמות |
| מלוחים חוצצי פוספט (PBS) (1x) (1 ליטר) | נתרן כלורי | 8 גרם |
| אשלגן כלורי | 0.2 גרם |
| נתרן פוספט דיבסיסי | 1.44 גרם |
| אשלגן פוספט מונובייסיק | 0.24 גרם |
| כוונן את ה- pH ל- 7.4 | |
טבלה 2: יישום אלכוהול מדורג ואצטון להתייבשות רקמות (שלב 2.5)
| רכיב | זמן |
| 50% אתנול | 10 דק' |
| 70% אתנול | 10 דק' |
| 95% אתנול | 10 דק' |
| 100% אתנול | 20 דק' |
| 100% אתנול | 20 דק' |
| 100% אצטון | 30 דק' |
| 100% אצטון | 30 דק' |