$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת בעלי חיים וקיבוע כליות
- בצע קיבוע זילוח לפי השלבים הבאים.
- להרדים את העכבר על ידי שאיפת איזופלורן (3%, 2.0 ליטר/דקה) ומתן תוך-צפקי של מדטומידין הידרוכלוריד (0.3 מ"ג/ק"ג), טרטרט בוטורפנול (5 מ"ג/ק"ג) ומידזולאם (4 מ"ג/ק"ג) (ראו טבלת חומרים).
- יש לערבב את בעל החיים עם 20 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS, pH 7.4) ו-30 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד (PFA) בחיץ פוספט (PB) דרך החדר השמאלי של הלב.
- בצע את קיבוע טבילה מיד לאחר קיבוע זילוח דגימת כליות.
- טבלו את הכליה ב-4% PFA בטמפרטורה של 4°C למשך 16 שעות נוספות, ולאחר מכן שטפו אותה עם PBS במשך שעתיים (שלוש פעמים)9 (איור 1).
זהירות: פורמלדהיד ופרפורמלדהיד הם חומרים מגרים רעילים. טפל בריאגנטים במכסה אדים עם ציוד מגן אישי מתאים.
2. דה-קולוריזציה והסרת שומנים
- הכינו CUBIC-L (קוקטיילים ברורים ובלתי חסומים להדמיית מוח/גוף וניתוח חישובי) לדה-קולוריזציה ודה-ליפידיזציה המורכבים מ-10 wt% של Triton X-100 ו-10 wt% של N-buthyldiethanolamine (ראו טבלת חומרים), בעקבות דוחות שפורסמו בעבר.
- בצע דה-קולוריזציה והסרת שומנים על ידי CUBIC-L לפי השלבים הבאים.
- טבלו את הכליה הקבועה ב-7 מ"ל של 50% (v/v) CUBIC-L (תערובת של 1:1 מים ו-CUBIC-L) בצינור תחתון עגול של 14 מ"ל (ראו טבלת חומרים) עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר במשך 6 שעות (איור 2A). לאחר מכן, לטבול אותו 7 מ"ל של CUBIC-L בצינור תחתון עגול 14 מ"ל עם רעד עדין ב 37 ° C במשך 5 ימים.
- יש לרענן את CUBIC-L מדי יום במהלך תהליך זה. לאחר תהליך הסרת הצבע והסרת השומנים, שטפו את הכליה עם PBS בטמפרטורת החדר במשך שעתיים (שלוש פעמים) (איור 1). השתמשו בכף ניפוק לטיפול בדגימות (איור 2B).
3. צביעה אימונופלואורסצנטית מלאה
- הכינו את מאגרי הצביעה.
- הכינו את חיץ הצביעה לנוגדנים ראשוניים על ידי ערבוב 0.5% (v/v) Triton X-100, 0.5% קזאין ב-PBS ו-0.05% נתרן אזיד.
- הכינו את חיץ הצביעה לנוגדנים משניים על ידי ערבוב של 0.5% (v/v) Triton X-100, 0.1% קזאין ב-PBS ו-0.05% נתרן אזיד.
- לבצע צביעה עם נוגדנים ראשוניים.
- Immunostain הכליה delipidated עם נוגדנים ראשוניים (1:100 או 1:200, ראה טבלה של חומרים) ב חיץ מכתים ב 37 ° C עם רעד עדין במשך 7 ימים.
הערה: כמות חיץ הכתמים הדרושה לכליה אחת היא 500-600 μL (איור 2C).
- שטפו את הכליה עם 0.5% (v/v) Triton X-100 ב-PBS (PBST) בטמפרטורת החדר למשך יום אחד (איור 1).
- לבצע צביעה עם נוגדנים משניים.
- אימונוסטיין הכליה עם נוגדנים משניים (1:100 או 1:200, ראה טבלת חומרים) בחיץ הצביעה ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד עדין במשך 7 ימים. שטפו את הכליה עם PBST בטמפרטורת החדר במשך יום אחד (איור 1).
- לאחר הקיבוע, טבלו את הכליה בפורמלדהיד 1% ב-PB (תערובת של 1:36 של 37% פורמלדהיד ו-PB) במשך 3 שעות, ושטפו אותה עם PBS בטמפרטורת החדר במשך 6 שעות (איור 1).
4. התאמת אינדקס השבירה (RI)
- הכינו את CUBIC-R+.
- הכינו CUBIC-R על ידי ערבוב של 45 wt% של 2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine ו-30 wt% של nicotinamide (ראו טבלת חומרים).
- הכן את CUBIC-R+ להתאמת אינדקס השבירה (RI) על ידי הוספת 0.5 v% של N-buthyldiethanolamine ל- CUBIC-R בעקבות הדוחות שפורסמו בעבר.
- בצע את התאמת RI.
- יש לטבול את הכליה ב-7 מ"ל של 50% (v/v) CUBIC-R+ (תערובת של 1:1 מים ו-CUBIC-R+) בצינור תחתון עגול של 14 מ"ל עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר למשך יום אחד. לאחר מכן, טבלו אותו ב-7 מ"ל של CUBIC-R+ בצינור תחתון עגול של 14 מ"ל עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר במשך יומיים (איור 1).
הערה: אף על פי שהכליה צפה ב-50% CUBIC-R+ בתחילת התאמת RI, היא שוקעת ונעשית שקופה ב-CUBIC-R+ בסוף התהליך (איור 2D).
5. רכישה ושחזור של תמונות
- טבלו את הכליה התואמת ל-RI בתערובת של שמן סיליקון (RI = 1.555) ושמן מינרלי (RI = 1.467) (55:45) במהלך רכישת תמונה (RI = 1.51) (איור 3).
- קבל תמונות תלת-ממדיות של הכליה כולה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מותאם אישית (ראה טבלת חומרים). אסוף את כל נתוני התמונה הגולמיים בתבנית TIFF של 16 סיביות. הצג באופן חזותי ולכוד את התמונות שעובדו בתלת-ממד באמצעות תוכנת ניתוח ההדמיה (Imaris, ראה טבלת חומרים).
