בדיקת אימונופלואורסנציה לאיתור אגרגטים אלפא-סינוקלאין בקטע ביופסיה של העור

תקציר

מקור: Vacchi, E., et al. התמקדות בצברי אלפא סינוקלאין בסיבי עצב היקפיים עוריים על ידי בדיקת אימונופלואורסנציה צפה חופשית. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים בדיקת אימונופלואורסצנטיות לזיהוי אגרגטים אלפא-סינוקלאין ספציפיים למחלות נוירודגנרטיביות על קטעי ביופסיה של העור. אימונוסטיין צף חופשי משמש כדי לתייג באופן פלואורסצנטי את ההידרולאז קרבוקסיל-טרמינלי ואת אגרגטי אלפא-סינוקלאין בנוירונים העוריים. תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, תאים עם פלואורסצנטיות משני הנוגדנים מצביעים על נוכחות של אגרגטים אלפא סינוקלאין בנוירונים העוריים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון,

1. אוסף ביופסיות עור

1. יש לתת לרופא מוסמך לבצע את ביופסיית העור במסגרת קלינית מתאימה.
2. בחר את האזור לביצוע ביופסיית העור ונקה אותו עם ספוגית אלכוהול.
3. הכינו את תמיסת ההרדמה עם 1 סמ"ק לידוקאין 2%.
4. כאשר המחט מקבילה לאזור, מזריקים הרדמה מקומית תת עורית.
5. לאחר בדיקת השפעת ההרדמה, יש לקחת את האגרוף החד פעמי בקוטר 3 מ"מ ולהפעיל לחץ סיבובי ועדין כלפי מטה כדי לסובב אותו מטה דרך האפידרמיס והדרמיס, עד להגעה לשומן התת עורי.
6. משכו את האגרוף.
7. השתמשו במלקחיים חד פעמיים כדי למשוך בעדינות את תקע העור.
8. השתמש מספריים כדי לחתוך את הבסיס של הדגימה ברמה של רקמת השומן.
9. הניחו את הדגימה בצינור המכיל 10 מ"ל של תמיסת קיבוע פריודאט-ליזין-פרפורמאלדהיד (PLP).
10. יש לחטא את האזור ולכסות אותו בתחבושת דבק.

2. קיבוע רקמות ואחסון

1. צור פתרון קיבוע PLP טרי (ראה טבלה 1).
2. מיד לאחר איסוף ביופסיית העור, לטבול אותו בצינור המכיל 10 מ"ל של תמיסה קיבוע PLP ולדגור אותו לילה (O/N) ב 4 ° C.
3. יום לאחר מכן, מתחת למכסה המנוע, הסר את קיבוע ה- PLP בעדינות ובאותו צינור, שטוף את הביופסיה 3 פעמים במשך 5 דקות עם 5 מ"ל של תמיסה של 0.1 M Sorensen (טבלה 1).
4. יש להשליך את תמיסת סורנסן ולדגור על הביופסיה עם 5 מ"ל של תמיסה מגינה מפני הקפאה O/N בטמפרטורה של 4°C.
5. אחסן את הביופסיה ב -4 ° C אם החתך עם cryotome מבוצע בתוך שבוע אחד; לאחסן את הביופסיה ב -20 ° C אם החתך מבוצע בתוך 3 חודשים; להטביע את הביופסיה ב cryomold (שלבים 3.2-3.4) ולאחסן אותו ב -80 ° C כדי לשמר אותו לתקופה ארוכה יותר של זמן.

3. רקמות חתוכות עם Cryotome

1. הגדר את cryotome על -20 °C.
2. קחו קריומולד ומלאו אותו במדיום ההטבעה בהקפאה. הימנעו מיצירת בועות.
3. בעזרת פינצטה טובלים את הביופסיה בתווך ההטבעה הקריו-קריומדינית כאשר ציר האורך (אפידרמיס - דרמיס) מקביל לתחתית הקריומולד.
4. הצמד להקפיא את הדגימה עם חנקן נוזלי כדי לקבל קובייה מוצקה של מדיום הטבעה קריו, המכיל את הביופסיה בכיוון הנכון.
5. שים את הדגימה בהקפאה והמתן 30 דקות כדי לאפשר לביופסיה להתאקלם.
6. תקן את הדגימה על cryostat לחתוך 50 מיקרומטר חתכים.
7. בעזרת מברשת קטנה, מעבירים את קטעי ההקפאה בצלחת באר 96 המכילה 200 מיקרוליטר של תמיסת נוגדי הקפאה בכל באר. קטע אחד לכל באר.
8. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C.
   הערה: אם לא מנתחים את כל הביופסיה, חותכים אותה רק באופן חלקי. במקרה זה, יש לאחסן את החלקים ב -20 ° C ואת החלק הנותר של הביופסיה ב -80 ° C כדי לשמר אותו לתקופה ארוכה יותר של זמן.

4. צביעת אימונופלואורסנציה

1. ממלאים צלחת 96 בארות, עם 100 μL של תמיסת כביסה.
2. העבירו את המקטעים לניתוח מצלחת האחסון לפלטה החדשה המכילה את תמיסת הכביסה. מקטע אחד לכל באר (4 מקטעים לכל אתר אנטומי, לכל מטופל: בדרך כלל סה"כ 12 חלקים לכל מטופל).
3. השאירו את החלק בתמיסת הכביסה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT). מעבירים את החלק לבאר אחרת המכילה את אותה תמיסה וחוזרים על הכביסה.
4. העבר את המקטעים לבארות חדשות המכילות 100 μL של תמיסת חסימה ודגור לפחות 90 דקות ולכל היותר 4 שעות ב- RT.
5. יש לדלל את הנוגדנים העיקריים anti-PGP9.5 (Rabbit polyclonal, 1:1000) ו-anti-5G4 (עכבר חד-שבטי, 1:400) בתמיסת העבודה.
6. מעבירים את המקטעים לבארות חדשות המכילות 100 μL של תמיסת העבודה של הנוגדנים הראשוניים ודגרים עליהם O/N ב-RT.
7. כשלב 4.3, שטפו את החלקים פעמיים במשך 10 דקות לפחות ב-RT, עם 100 מיקרוליטר של תמיסת כביסה.
8. לדלל את הנוגדנים המשניים (מצומדים עם פלואורופורים שונים), עז נגד ארנב כדי לזהות PGP9.5 (1:700) ועז נגד עכבר כדי לזהות 5G4 (1:700) בתמיסת העבודה.
9. העבר את החלקים לבארות חדשות המכילות 100 μL של תמיסת העבודה של הנוגדנים המשניים למשך 90 דקות ב- RT. מנקודה זו, כסו את צלחת הבאר 96 ברדיד אלומיניום כדי למנוע הלבנה של פלואורופור מצומד עם נוגדנים משניים.
10. בשלב 4.3, שטפו את החלקים פעמיים במשך 10 דקות לפחות, עם 100 מיקרוליטר של תמיסת הכביסה.
11. העבירו את המקטעים לבארות חדשות המכילות 100 μL של 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, מדולל 1:5,000 במי מלח חוצצי פוספט [PBS] 1x) למשך 5 דקות ב-RT.
12. בשלב 4.3, שטפו את החלקים פעמיים במשך 10 דקות לפחות, עם 100 מיקרוליטר של תמיסת הכביסה.
13. הרכיבו את המקטעים על שקופית במיקום הנכון והימנעו מקיפול שגוי.
14. הוסף כמה טיפות ממדיום ההרכבה על המגלשה וכסה בכיסוי.
15. יש לתת לשקופיות להתייבש לפני השימוש במיקרוסקופ קונפוקלי/פלואורסצנטי.
16. אחסן את השקופיות בתיבה מתאימה בטמפרטורה של 4°C תוך הימנעות מחשיפה לאור. אם האות מאוחסן במדויק, הוא יהיה גלוי למשך כ-6 חודשים.
    הערה: העברת קטע מצלחת הבאר 96 המכילה את הפרוסות שזה עתה נחתכו לצלחת באר 96 המכילה את תמיסת הכביסה (שלב 4.1) מתבצעת באמצעות מברשת קטנה המסייעת להרים את הביופסיה. לאחר העברת הקטע לבאר הראשונה, בכל פעם שצריך לדגור את הפרוסה בתמיסה אחרת, מעבירים אותה מבאר לבאר בעזרת המברשת.

5. הדמיה אימונופלואורסצנטית

1. הצג מקטעים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך או מיקרוסקופ קונפוקלי (הגדלה של 20X, 40x ומעלה, השתמש במסגרות עוקבות של הפרשים של 2 מיקרומטר בתוכנית Z-stack לקבלת התוצאות הטובות ביותר).
2. קבלת תמונות באמצעות מצלמה מחוברת במיקרוסקופ
3. השתמש בתוכנת הדמיה מתאימה (כלומר ImageJ) כדי לנתח אותות חיוביים במקטעים במונחים של פיזור מרחבי ועוצמת האות. לשם כך, בצע את השלבים המוזכרים להלן.
   1. פתח את הקובץ באמצעות תוכנת ImageJ.
   2. לחצו על Image > צבע > ערוצים מפוצלים כדי לנתח כל ערוץ צבע.
   3. לחץ על תמונה > ערימה > פרוייקט Z כדי להשיג מיזוג של רכישות מקטעים מרובות.
   4. לחצו על 'תמונה' > צבע > למזג ערוצים לקבלת מיזוג של ערוצי צבע שונים מאותה רכישה.

טבלה 1: פתרונות נדרשים. רשימת הפתרונות הדרושים לפרוטוקול ותיאור קצר של אופן הכנתו.

)

תמיסת נוגדי הקפאה (יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד 6 חודשים)	30% גליצרול<בר/> 30% אתילן גליקול<בר/> 30% dH2O 10% 2x חיץ פוספט
פתרון חסימה (היכונו כרגע)	4% רגיל סרום עיזים 1% Triton X-100 בתמיסת כביסה
Cryo-protectant (יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד 6 חודשים)	20% גליצרול<בר/> 80% הפתרון של סורנסן
תמיסת דיסודיום מימן פוספט (יש לאחסן ב-RT עד 6 חודשים)	0.45M דיסודיום מימן פוספט (Na2HPO4) ב dH2O מסננים בבקבוק סטרילי
תמיסת ליזין (יש לאחסן ב-4°C למשך עד 3 שבועות)	50% של 0.3M L-ליזין monohydrochloride תמיסת 50% מהפתרון של 0.1M Sorensen pH 7.6 pH 7.4, מסנן בבקבוק סטרילי
Paraformaldehyde (PFA) 8% (יש להכין מתחת למנדף ולאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודש)	2.6M PFA ב-dH2O (עד 55°C_do לא יעלה על 60°C כדי למנוע היווצרות חומצה פורמית) מסננים בבקבוק סטרילי
חיץ פוספט 2x (יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד 6 חודשים)	6% מונוסודיום פוספט (NaH2PO4) תמיסה 45% תמיסת דיסודיום פוספט (Na2HPO4) ב-dH2O
פתרון קיבוע PLP (היכונו כרגע, מתחת למכסה המנוע	25% פרפורמאלדהיד 8% 0.01M נתרן (meta)periodate 75% תמיסת ליזין
נתרן דימימן פוספט מונוהידרט (יש לאחסן ב-RT עד 6 חודשים)	0.52M נתרן דימימן פוספט מונוהידראט (NaH2PO4 * H2O) ב dH2O מסננים בבקבוק סטרילי.
הפתרון של סורנסן (יש לאחסן ב-4°C למשך עד חודש אחד)	2.5% תמיסת מונוסודיום פוספט 18.7% תמיסת דיסודיום פוספט pH 7.6, ב- dH2O
תמיסת כביסה (היכונו כרגע)	0.25 מטר Trizma בסיס 0.26M NaCl pH 7.6, ב- dH2O
פתרון עבודה (היכונו כרגע)	50% פתרון חסימה 50% פתרון כביסה

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
5G4 (אנטי אדם αSyneclein 5G4)	אנליטיק Jena Roboscreen	847-0102004001	עכבר חד-שבטי
AlexaFluor 488 עז נגד ארנב IgG	Invitrogen	1971418	2 מ"ג/מ"ל
AlexaFluor 594 עז נגד עכבר IgG	Invitrogen	1922849	2 מ"ג/מ"ל
תמיסת דיסודיום מימן פוספט	מרק מיליפור	106586
אתילן גליקול	סיגמא-אולדריץ'	324558
גליצרול	סיגמא-אולדריץ'	G7757
ל-ליזין מונוהידרוכלוריד	סיגמא-אולדריץ'	L5626
פרפורמאלדהיד	אולדריץ' כימיה	441244
PGP9.5	אבקאם	dorit_15503	ארנב רב-שבטי
נתרן כלורי	סיגמא	S3014
נתרן דימימן פוספט מונוהידראט	מרק מיליפור	106346
נתרן (מטה)פריודאט	סיגמא-אולדריץ'	S1878
בסיס טריזמה	סיגמא	T1503
טרייטון X-100	סיגמא-אולדריץ'	X100
Vectashield	מעבדות וקטוריות	H-1000	אמצעי הרכבה