שימוש בטומוגרפיה בתיווך פלואורסצנטי להערכת דלקת מעיים מורין

תקציר

מקור: Nowacki, T. M., et al. טומוגרפיה בתיווך פלואורסצנטי לזיהוי וכימות של דלקת מעיים מורין הקשורה למקרופאגים. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים טכניקה להערכת חדירת מקרופאגים במעי במודל מורין של קוליטיס באמצעות טומוגרפיה בתיווך פלואורסצנטי (FMT). עם גרימת קוליטיס בעכבר באמצעות דקסטרן נתרן סולפט (DSS), מזריקים לחיה נוגדנים המזהים את סמן הגליקופרוטאין F4/80 על מקרופאגים שחדרו למעי הגס. לאחר מכן העכבר מצולם במכשיר FMT שבו אותות הפלואורסצנטיות וההחזרה משוחזרים לתמונה תלת-ממדית כדי לקבוע את הפיזור המרחבי והעוצמה של הפלואורסצנטיות.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. חומרים ומערך ניסויי

1. טיפול בבעלי חיים.
   1. יש להשתמש בעכברים תואמי מין וגיל מכל זן רגיש ל-DSS (לדוגמה, C57BL/6) במשקל גוף של 20-25 גרם.
   2. תכננו לפחות חמישה עכברים או יותר בכל קבוצת ניסוי ושכנו את העכברים בהתאם להנחיות המקומיות לטיפול בבעלי חיים.
   3. ספקו תזונה סטנדרטית של מכרסמים צ'או ומי שתייה אוטוקלאביים אד ליביטום.
   4. הסר את הצ'או הסטנדרטי והחלף אותו בצ'או ללא אספסת לפחות שלושה ימים לפני הסריקה כדי להפחית פלואורסצנטיות אוטומטית אנדולומינלית.
2. השראת קוליטיס חריפה הנגרמת על ידי DSS.
   1. להמיס 2 גרם של DSS (משקל מולקולרי ~ 40,000 Da) ב 100 מ"ל של מי שתייה autoclaved כדי לקבל 2% (w/v תמיסה).
   2. מלא את אספקת השתייה של העכברים באופן בלעדי עם פתרון DSS ולהעריך 5 מ"ל של נוזלים לעכבר ליום. לספק את אותם מי שתייה ללא DSS לעכברי הביקורת.
      הערה: עקוב אחר העכברים מדי יום עד סוף הניסוי. הרדימו עכברים שמאבדים יותר מ-20% ממשקל גופם ההתחלתי או שמתים (כלומר, יציבה כפופה באופן מתמשך, ירידה בתנועה, נשימה מאומצת, פרווה זקופה במידה ניכרת) בהתאם להנחיות המקומיות החלות על רווחת בעלי חיים.
3. הכנת טומוגרפיה בתיווך פלואורסצנטי.
   1. תייג את הנוגדן הרצוי (לדוגמה, עכבר נגד עכבר F4/80) בצבע פלואורסצנטי (למשל, ציאנין7,_עירור λ: 750 ננומטר,_פליטת λ: 776 ננומטר) כמתואר בפרוטוקול היצרן. דיאליזה נוגדן מטוהר בקרום דיאליזה מתאים (גודל נקבוביות < 50-100 kDa) כנגד 1 ליטר של 0.15 M נתרן כלורי למשך שעתיים לפחות או לילה.
      1. להעביר את הנוגדן ל 1 L של 0.1 M NaHCO₃ ו dialyze לפחות 2 שעות.
      2. יש להמיס את הכמות הנדרשת של צבע פלואורסצנטי בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) (10.8 מיקרוליטר/מ"ג נוגדן) ולהוסיף אותו לתמיסת הנוגדנים. השתמשו בצבע הפלואורסצנטי בעודף טוחנת של פי 20 כדי להשיג יחס צבע לחלבון של 1:3.
      3. יש לדגור בחושך בטמפרטורה של 4°C למשך שעה אחת. יש להסיר נוגדנים ללא תווית על ידי דיאליזה כנגד 1 ליטר של נתרן 0.15 M או באמצעות עמודת התפלה PD-10 ולפתור במי מלח חוצצי פוספט (PBS) ליישום in vivo.
      4. קבע את ריכוז הנוגדנים הסופי ואת יחס התיוג על ידי ספקטרופוטומטריה.
      5. למדוד את ריכוז החלבון בספיגה של 250-330 ננומטר ולשקול ספיגה נוספת על ידי הצבע. תקן את הספיגה המרבית ב-280 ננומטר (חלבון) ב-11% מהספיגה המרבית ב-750 ננומטר (השלב הבא) לסימון ציאנין.
      6. למדוד דילול של התרכובת (בדרך כלל 1:10) ב 250-800 ננומטר ולמצות את ריכוז ציאנין7 ב 750 ננומטר.
      7. קבע את יחס הצבע לחלבון כ: צבע / נוגדן = ספיגה מקסימלית ב 750 ננומטר / 200,000 / (ספיגה מקסימלית ב 280 ננומטר - 0.11 x ספיגה מקסימלית ב 750 ננומטר) / 170,000.
      8. שמור את תמיסת הנוגדנים על 4 ° C ולהגן עליה מפני אור כדי למנוע הלבנה לפני ההזרקה.
   2. טען את נפח תמיסת הנוגדנים הדרוש במזרק סטרילי מיד לפני ההזרקה והגן עליו מפני אור עד לשימוש.
   3. לקבוע את העיתוי האופטימלי של הזרקת הבדיקה ואת הליך הסריקה, בהתאם פרמקוקינטיקה נותב.
   4. מרדימים את העכברים באמצעות איזופלורן בשאיפה של 1.5 - 2.5% בחמצן או מניחים אותם היטב בריסון ייעודי להזרקת וריד הזנב של הנוגדנים המסומנים.
   5. עבור נוגדנים באורך מלא, יש להזריק את הנוגדן המסומן לפחות 24 שעות לפני הסריקה, כגון עבור הדמיה של מקרופאגים F4/80 נגד עכבר בקוליטיס מורין. יש להזריק עכברים דרך הווריד דרך וריד הזנב עם נוגדן מסומן בכמות המתאימה ל-2.0 ננומול צבע.
   6. השתמש בנוגדנים לא ספציפיים המסומנים באותה מידה (למשל, IgG של חולדה או איזוטיפ אחר המתאים למורשת הנוגדנים הראשונית) כבקרת איזוטיפ במינונים שווי ערך לאלה של הבדיקה הספציפית.
      הערה: התוצאות של סריקות in vivo לאחר הזרקת תרכובת הבקרה יכולות לשמש כהתייחסות לפענוח נתוני הדמיית הבדיקה הספציפיים.
   7. השתמש בסכין גילוח חשמלי כדי לגלח את פרוות בעלי החיים באזור הבטן כדי למזער את השתקפות האור ובליעתו.

2. ציוד טכני

1. השתמשו במכשיר טומוגרפיה וטרינרית בתיווך פלואורסצנטי (FMT) עבור פלואורסצנטיות של חיות קטנות (איור 1).
2. צור מחקר חדש עבור כל פרויקט על ידי לחיצה על כפתור "מחקר חדש" וכלול בתיאור המחקר את העוקבים הרלוונטיים, כולל פרמטרי ההדמיה והמינונים להתייחסות עתידית.
3. במסגרת מחקר זה, צור קבוצות לימוד בהתאם לעיצוב המחקר המתאים (למשל, עבור העוקב הספציפי ובקרת איזוטיפ לא ספציפית) על ידי לחיצה על כפתור "קבוצת לימוד חדשה". ציידו כל קבוצת מחקר במספר המתאים של בעלי חיים.
4. כיול המערכת עבור מבני נותב.
   1. בצע את הכיול עבור כל אצווה של עוקבים כדי לנרמל את השונות בתיוג ולאפשר מדידה כמותית מנתוני OI.
   2. עקוב אחר הנחיות יצרן המכשיר לכיול של כל מערכת בנפרד; לאחר בחירת "הוסף עוקב חדש", המערכת תספק מדריך לאורך השלבים. לספק את דילול של פתרון נוגדנים להחיל ואת הריכוז המוחלט המחושב של נותב בבדיקה.
   3. עבור FMT, השתמש בפנטום מחקה רקמות בעל תכונות עובי וספיגה מוגדרות (הדומות לרקמה חיונית) ומלא אותו בנפח מסוים של תמיסת הנוגדנים בה נעשה שימוש. מדוד זאת במכשיר FMT.
      הערה: המערכת תשתמש במדידת הייחוס של הגשושית שסופקה, יחד עם הריכוז הנתון, כדי לחשב ריכוזי נותב מוחלטים ממדידות עתידיות in vivo.
5. יש להשתמש בקסטת בדיקה מחוממת בטמפרטורה של 42°C.
   הערה: זה מונע מהעכברים להפוך היפותרמיים במהלך הבדיקה.

3. הרדמה של בעלי חיים

1. השתמש בזרימה רציפה של 1.5 - 2% איזופלורן נפח ([2-כלורו-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane]) ו- 1.5 L O₂/min כדי להרדים את העכברים. השתמש במערכות אינהלציה שתוכננו במיוחד להרדמת מכרסמים (וופורייזר איזופלורן) כדי לשלוט בקלות בעומק ההרדמה ולמזער את חשיפת הצוות.
2. הניחו את העכבר בתא השראות חסין דליפות והפעילו את הוופורייזר לאספקת איזופלורן (100% (v/v), 5 vol% בחמצן, 3 ליטר/דקה). עקוב אחר העכבר עד שהוא שוכב ומחוסר הכרה.
3. הניחו אותו בקלטת הבדיקה לטומוגרפיה, עם שאיפת איזופלורן רציפה דרך חרוט האף במינון של 100% v/v, 1.5% vol% בחמצן, 1.5 ליטר/דקה כדי למזער את התנועה במהלך הבדיקה. להליכים הנמשכים יותר מ -5 דקות, יש למרוח משחת עיניים על עיני העכבר כדי למנוע נזק לקרנית.
4. להעריך את עומק ההרדמה על ידי בדיקת הרפלקסים. הנח את העכבר על גבו; אם הרדמה מספיקה, העכבר לא צריך להסתובב. צבוט את העכבר ברכות בין אצבעות רגליו; אם ההרדמה מספיקה, הרגל לא תיסוג (שלב של סובלנות כירורגית).

4. סריקת טומוגרפיה בתיווך פלואורסצנטי

הערה: התאם את הפרטים הבאים, שהם ספציפיים למערכת FMT המשמשת במחקר זה (ראה טבלת חומרים) עבור התקני הדמיה חלופיים להחזרה פלואורסצנטית או מערכות FMT, לפי הצורך.

1. הניחו את העכבר המרדים על גבו בקלטת הבדיקה.
2. בצע את הליך הסריקה.
   1. הכנס את הקלטת למערכת ההדמיה וסגור אותה מיד כדי להבטיח הרדמה רציפה. בחר את המדגם המתאים מקבוצת המחקר שנוצרה קודם לכן. בחר את העוקב המנוהל מהתפריט הנפתח כדי לוודא שהערכים עבור ריכוז נותב מחושבים כהלכה.
   2. רכוש תמונת החזרת פלואורסצנטיות באורך הגל המתאים (720 ננומטר עבור ציאנין7) לתכנון סריקה ושרטט את שדה הסריקה על ידי לחיצה על כפתור "רכוש תמונה".
   3. ראו ששדה הסריקה מופיע כשכבת-על בתמונת ההשתקפות הפלואורסצנטית. התאימו אותו לאזור העניין (למשל, המעי הגס או הבטן), הימנעו מאוויר או מאזורים של פרווה שנותרה. בהתאם ליעד התמונה, הגדר את מספר נקודות נתוני התמונה בשדה הסריקה על-ידי בחירה ברזולוציית שדה הסריקה הגסה עד בינונית ועדינה בתפריט מימין.
      הערה: זכור כי שדה סריקה עדין עשוי להציע רזולוציה מרחבית טובה יותר במחיר של זמן סריקה ארוך יותר באופן משמעותי.
   4. התחל רכישת נתונים/תמונות באורך הגל שנבחר על ידי לחיצה על "scan."
      הערה: זמן הסריקה לסריקה בינונית-עדינה של כל הבטן יהיה כ-5 דקות; בזמן זה, כל נקודת נתונים מוארת בנפרד על ידי לייזר עירור, ואת הפלואורסצנטיות המתקבלת נרשמת.
   5. הסר את בעל החיים מקלטת ההדמיה בסוף הסריקה ואפשר לבעל החיים להתאושש לחלוטין לפני החזרתו לכלוב.
   6. חזור על ה- FMT במידת הצורך בנקודות זמן שונות במהלך הניסוי (למשל, ימים 0, 5 ו- 9 - 10 (סוף הניסוי)), אך שקול את הצטברות הנוגדנים בגוף, ובכך מגביר את אות פלואורסצנטיות הרקע.

5. שחזור נתונים ופרשנות

1. השתמש בכלי השחזור של תוכנת ההדמיה המתאימה כדי ליצור מפות תלת-ממדיות של התפלגות הפלואורסצנטיות מנתוני ההדמיה הגולמיים; סריקות מתווספות אוטומטית לכלי השחזור כאשר בעת הסריקה, הפונקציה "הוסף לתור השחזור" נבחרת.
   1. אחרת, בחר את הסריקות מהתפריט הנפתח תחת קבוצת המחקר והלימוד המתאימים, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הסריקה ובחר "הוסף לשחזור".
2. לניתוח נוסף, טען ערכת נתונים לתוכנת הניתוח. מהתפריט הנפתח בסרגל העליון, בחר את המחקר המתאים ולאחר מכן בחר את קבוצת המחקר ואת החיה הבודדת מהתפריט מימין; כל הסריקות שבוצעו עבור בעל חיים זה יוצגו. בחר את הסריקה הנכונה ולחץ על "load."
   הערה: השחזור התלת-ממדי של התפלגות הנותב יופיע משמאל כשכבת על של תמונת ההחזרה הפלואורסצנטית שנרכשה בתחילה. ניתן לסובב ולהגדיל את המודל לניתוח קל יותר.
3. זהה מוקדים של הצטברות תוויות לא ספציפיות (למשל, כבד או שלפוחית השתן) על מפות תלת-ממדיות משוחזרות והבדיל מרקמות המטרה (למשל, מעי או מעי).
4. בסרגל העליון, בחר את צורת החזר ההשקעה המתאימה ביותר ליעד. תיוג רקמת היעד כאזורי עניין (ROI) על ידי הצבת כלי המדידה המתאימים בתוכנת הניתוח; התוכנה תספק עוצמת פלואורסצנטיות עבור החזר ההשקעה, כמו גם כמויות טוחנות (פיקו) של הנותב שעבורו כויל הסריקה.
5. בחר את הסכום הכולל של נותב בהחזר ההשקעה המתאים, מנורמל עבור גודל החזר ההשקעה, כשווה הערך המתאים ביותר להערכת פעילות המחלה בקורלציה עם חדירה דלקתית (היסטולוגיה).
   הערה: ניתן לבחור תכונות אחרות של החזר ההשקעה במידת הצורך כמייצגות את המודל המסוים.

תוצאות

איור 1. הדמיה טומוגרפית של חדירת מקרופאגים בקוליטיס מורין.

FMT סריקות בעכברים קוליטיים ובקרות לא קוליטיות נתנו נוגדן מצומד ציאנין7 נגד מורין F4/80 (n = 5 לכל קבוצה). (A) גרף עמודות: עוצמת הפלואורסצנטיות הכוללת ב-pmol של צבע נקבעה בהחזר ההשקעה ותוארה ±-SEM. תמונות מייצגות מוצגות עם עוצמת פלואורסצנטיות מקודדת בצבע המתאימה למידת החדירה הדלקתית בעכ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ריאגנטים
דיאטה נטולת אספסת	Harlan Laboritories, מדיסון, ארה"ב	2014
משחת עיניים Bepanthen	Bayer, Leverkusen, גרמניה	80469764
דקסטרן סולפט נתרן (DSS)	TdB Consulatancy, אופסלה, שוודיה	DB001
אאוסין	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, גרמניה	E 4382
חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA)	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, גרמניה	E 9884
Florene 100V/V	Abbott, Wiesbaden, גרמניה	B506
המטוקסילין	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, גרמניה	HHS32-1L
O.C.T. תרכובת טק רקמות	Sakura, Zoeterwonde, הולנד	4583	קיבוע לניתוחים היסטולוגיים
מלח חוצץ פוספט, PBS	Lonza, Verviers, בלגיה	4629
נתרן כלורי 0,9%	Braun, Melsungen, גרמניה	5/12211095/0411
אבקת סודיום ביקרבונט	Sigma Aldrich Deisenhofen, גרמניה	S5761
דיאטה סטנדרטית	Altromin, Lage, גרמניה	1320
Tissue-Tek Cryomold	Sakura, Leiden, הולנד	4566
Hemoccult (מבחן נייר guaiac)	Beckmann Coulter, גרמניה	3060
נוגדן ביוטין חולדה נגד עכבר נגד F4/80	סרוטק, אוקספורד, בריטניה	MCA497B
ביוטין חולדה-נגד עכבר נגד GR-1	BD Pharmingen , היידלברג גרמניה	553125
Streptavidin-Alexa546	בדיקות מולקולריות, דרמשטאדט, גרמניה	S-11225	עירור/פליטה מרביים: 556/573NM
נוגדן נגד עכברוש נגד עכבר נגד CD11b TC	Calteg, Burlingame, ארה"ב	₪2b06
נוגדן מטוהר נגד עכבר F4/80	BioLegend, לונדון, בריטניה	123102
דאפי	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, גרמניה	D9542
נוגדן מצומד נגד עכברוש מסוג FITC	BD Pharmingen, Heidelberg, גרמניה	553104
מאגר FACS	BD Pharmingen, Heidelberg, גרמניה	342003
Cy7 NHS אסטר	GE Healthcare Europe, פרייבורג, גרמניה	PA17104
MPO אליסה	Immundiagnostik AG, בנסהיים, גרמניה	K 6631B
Cy5.5 מסומן נוגדן F4/80 נגד עכבר	BioLegend, לונדון, בריטניה	123127	מוכן לשימוש מסומן נוגדנים (חלופי)
אנטיגן נגד עכבר F4/80 PerCP-ציאנין5.5	eBioscience, Waltham, ארה"ב	45-4801-80	מוכן לשימוש מסומן נוגדנים (חלופי)
DMSO (דימתיל סולפוקסיד)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, גרמניה	67-68-5
איזופלורן	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, גרמניה	792632
אתנול	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, גרמניה	64-17-5
אלבומין בסרום בקר (BSA)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, גרמניה	A4612
תמיסת מלח חוצצת Tris (TBS)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, גרמניה	SRE0032
ציוד
מערכת ציטומטריית זרימה FACS Calibur	BD Biosciences GmbH, היידלברג, גרמניה
FMT 2000 במערכת הדמיה Vivo	PerkinElmer Inc., Waltham, MA, ארה"ב (ארצות הברית)	FMT2000
תוכנת ניתוח הדמיה True Quant 3.1	PerkinElmer Inc., Waltham, MA, ארה"ב (ארצות הברית)	כלול FMT2000
מיקרוסקופ פלואורסצנטי Leica DMLB	Leica, 35578 Wetzlar, גרמניה	DMLB
Bandelin Sonopuls HD 2070	Bandelin, 12207 ברלין, גרמניה	HD 2070	הומוגנייזר קולי
אזמל חד פעמי מס' 10	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, גרמניה	Z692395-10EA
מספריים מצנבאום 14 ס"מ	Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, גרמניה	22398330
מזרק Luer Lock 5ml	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, גרמניה	Z248010
מחטי מזרק	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, גרמניה	Z192368
שפופרת פלקון 50 מ"ל	BD Biosciences, Erembodegem, בלגיה	352070