כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. תכנון מערך מותאם אישית פריסה וייצור
- צור גיליון אלקטרוני של רצפי פפטידים עם קריאות אלל מתאימות. המערך כולל 20 שורות ו-30 עמודות ויכול להכיל עד 20x30=600 נקודות עבור פפטידים. בהתאם למספר הכולל של פפטידים שנרשמו בשלב 1.5 מתורם מסוים אחד, ובהתבסס על ניסיון העבר שלנו עם שתי דוגמאות שניסינו, מערך 600 הנקודות יכול להכיל את כל הרצפים שנוצרו מ~2 מקרי השתלה נפרדים.
- תכנן באופן רציונלי את הדרך היעילה ביותר להתאים את קבוצות הפפטידים לתבנית של 600 נקודות של המערך.
- אם יותר מנושא אחד יכול להתאים למערך שלם אחד, הוסף שורות ריקות אחרי הרצפים של התורם הראשון כדי להתאים למספר הכולל של שורות שניתן לחלק ב- 30 (מספר המקומות בשורה במערך).
- מיד לאחר השורה הריקה האחרונה עבור קבוצת הרצפים הראשונה, הדבק את כל העמודה של תוכן הרצף ממקרה ההשתלה השני.
- חזור על שלבים אלה עד למילוי המערך ולא ניתן להוסיף עוד מארזים מבלי לחרוג מ- 600 הנקודות. אם שורות ריקות שלמות נותרות למילוי בתחתית, "העבר" את השורה הריקה כדי שתמוקם בין שתי קבוצות התורמים. מרווח רחב זה שנותר בין המקרים הופך את חיתוך הממברנה לאחר השלמת הסינתזה לקל יותר - לאחר שלב 2.2. מתחת.
- תכנת את רצפי הפפטידים בהקשר של פריסת המערך. התוכנית של סינתיסייזר SPOT לוקח פורמט טקסט של רצפים (שורה אחת, רצף פפטידי אחד), אשר ניתן להשיג ישירות על ידי שמירת הגיליון האלקטרוני שהתקבל משלב 1.1.4 כמסמך טקסט פשוט (ללא עמודות נוספות עבור שמות אלל, עמדות aa וכו ').
- הפעל סינתזת מערך פפטידים אוטומטית באמצעות סינתיסייזר SPOT. הפעולה כולה של הסינתזה מפורטת ב Kudithipudi et al. שים לב כי סינתזת Fmoc של שני מערכים לוקח ~ 4-5 ימים.
2. בדיקה ובדיקה מחדש של אנטיסרה מסדרת זמן של מושתל בודד.
הערה: מערך הממברנות של 600 נקודות כולל את הממדים ~ 7 ס"מ x 13 ס"מ. לאחר הסינתזה, ניתן לאחסן את המערכים בטמפרטורת החדר כממברנות יבשות למשך שנתיים לפחות כאשר הם מוגנים מפני אור ישיר. הימנע קיפול יתר של הממברנה כדי לשמור על תוחלת החיים שלה לשימוש חוזר.
- הרטיבו מחדש את מערך הממברנות באתנול ודמיינו כתמי פפטיד מוכתמים בפונסו S.
- יש לייבש מחדש את מערך הממברנות הנושא את הפפטידים לאחר הליך הדרגתי המותאם ל- Li et al.
- לטבול את קרום המערך ב 20 מ"ל של 100% אתנול.
- מוסיפים 20 מ"ל מים מזוקקים כדי לדלל את התמיסה לאתנול 50% ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
- שנה את תמיסת הטבילה ל 40 מ"ל של 100% מים שלוש פעמים ודגר 15 דקות בכל פעם.
- יש לשטוף במאגר תקין, למשל, 20 מ"ל של TBST (מלח חוצץ טריס עם 0.1%), שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחת.
- צביעת Ponceau S של המערך כדי להמחיש פפטידים סינתטיים
- הוסף 20 מ"ל של תמיסת Ponceau S מנוסחת מראש ישירות למערך הלחות ודגור במשך ~30 שניות עם ניעור.
- יש להזרים מים מזוקקים ברציפות על פני הממברנה כדי להסיר את הכתמים בצבע Ponceau S. במהלך התהליך, כתמים פפטידים של צבע אדום עשויים להיות גלויים.
- הפרידו את חלקי המערך עבור כל תורם על ידי חיתוך זהיר בין חלקי המערך למקרים פרטניים. סמן את הכיוון של כל מערך.
- מערך טרום בלוק.
- לחסום את הממברנה ב 20 מ"ל של חלב 5% ללא שומן מומס במאגר TBST. תמיסה זו על בסיס חלב תפיג עוד יותר את הכתמים בצבע Ponceau S. החלף את מאגר החלב מספר פעמים על מנת להשיג את תמונות הפפטיד הברורות ביותר.
- למטרות שמירת רשומות, צלמו את תמונת Ponceau S של המערך באמצעות מצלמה ידנית (לדוגמה באיור 1).
- יש להמשיך לחסום את הממברנה בחלב 5% ללא שומן בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה או בטמפרטורת החדר למשך שעתיים עם נדנוד.
- מערך הדגירה עם אנטי-סרום להשתלה.
הערה: יש לציין כי תופעה המכונה פרוזון או אפקט הוק עשויה לנבוע מהפרעה תלוית משלים בניתוח נוגדנים בסרום. כדי לעקוף בעיה זו, ניתן לשקול שלב אופציונלי לפני הטיפול בסרום עם חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA) או השבתת חום של דגימות בסרום.
- הסר את מאגר החסימה ושטוף את הממברנה עם 20 מ"ל TBST שלוש פעמים למחרת למשך 5 דקות בכל פעם.
- הוסף 20 μL של הסרום הגולמי של המקבל ל 20 מ"ל של חלב 2.5% במאגר TBST ודגור עם הממברנה במשך 2-3 שעות בטמפרטורת החדר. שימו לב שבסבב החיטוט הראשוני הזה, מומלץ להשתמש תחילה בסרום האחרון שלאחר ההשתלה (או ככל הנראה בסרום הרגיש ביותר) בסדרת הזמן. זאת בהתבסס על ההנחה שלדגימות מוקדמות יותר בסדרה, במיוחד מנקודות זמן לפני ההשתלה, יש פחות מגוון של אלונוגדנים שנוטים להתפתח עם הזמן. בדרך זו, ניתן להבדיל בבירור בין כל אפשרות של הפרעות אות כתוצאה מ"נשיאה" בין סבבי חיטוט לבין תגובתיות אלואנטיגנית מפותחת באמת עקב תגובות חיסוניות נגד השתל.
- לשטוף את המערך באמצעות 20 מ"ל של TBST ולדגור אותו עם נוגדן משני.
- שטפו את הממברנה שלוש פעמים במשך 10 דקות בכל פעם.
- יש לדגור עם נוגדן משני מסוג IgG-HRP (Horseradish peroxidase) נגד עזים בדילול של 1:10,000 במאגר TBST בתוספת חלב 1% למשך שעתיים נוספות.
- לשטוף ולפתח את הכתם.
- שטפו את הממברנה שלוש פעמים עם TBST במשך 10 דקות בכל פעם.
- בצע כימילומינסנציה משופרת (ECL) באמצעות 5 מ"ל של תמיסת לומינול מעורבבת טרייה עם 5 מ"ל של תמיסת מי חמצן לפיתוח הממברנה (למשך דקה אחת).
- הצג אותות ECL באופן חזותי באמצעות מכשיר הדמיה מתאים (כלומר, ChemiDoc Imaging Systems או Azure C600).
- סרוק וכמת את הכתם.
- שמרו את התמונות שפותחו (איור 2, תמונה תחתונה) ובצעו כימות של עוצמת הספוט.
3. השווה תגובתיות אנטי-סרום על פני סדרת זמן קלינית.
- הפשיט את המערך.
- בשלב זה, שמור על הקרום רטוב בכל עת.
- הפשיט את הממברנה על ידי דגירה עם 20 מ"ל של חיץ הפשטה מסחרי ב 37 ° C במשך 20 דקות, ולאחר מכן לשטוף את הממברנה עם TBST שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד. לאחר מכן חזור על שלבי החסימה (שלב 3.2) והחיטוט (שלב 3.3) באמצעות נסיוב אחר של המטופל שנלקח בנקודת זמן אחרת.
- לחסום קרום מופשט.
הערה: לאחר ההפשטה, ניתן לעשות שימוש חוזר בממברנה לסבב נוסף של חיטוט בסרום שונה מאותו מטופל בסדרת זמן.
- חסום את הממברנה באמצעות חיץ חלב 5% כמו קודם (ראה שלב 2.2).
- בדקו מחדש אנטי-סרום שונה מאותה סדרת זמן (חזרו על שלבים מ-2.3-2.6; דוגמה באיור 2, תמונה עליונה).
הערה: לאחר מכן ניתן להשתמש במערך שהופשט כדי לחקור דגימה נוספת בסרום. מאחר שהפפטידים מצומדים באופן קוולנטי למטריצה התומכת של הממברנה, הראינו שניתן לעשות שימוש חוזר במערך במשך עד 20 סיבובים של מחזורי הפשטה וחזרה מבלי לאבד את ביצועיו.
