איתור נוגדנים אנטי-גליקניים במחזור הדם עם מערך גליקן מודפס

תקציר

מקור: Olivera-Ardid, S. et al., Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carb Anti-Protein in Small Animals.J. Vis. Exp.(2019)

סרטון זה מדגים טכנולוגיית מערך גליקן מודפס לניתוח נוגדנים אנטי-גליקניים במחזור בסרום עכברים. הנוגדנים בסרום אינטראקציה עם גליקנים ספציפיים על השבב, אשר אושר על ידי immunostaining ואחריו סריקה פלואורסצנטית.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. ייצור Glycochips

1. הכנת Microarray
   1. הדפס את הגליקנים (50 מילימטר) ורב-סוכרים (10 מיקרוגרם/מ"ל) במי מלח חוצצי פוספט ב-300 מילימטר (PBS, pH 8.5) ב-6 עותקים משוכפלים על שקופיות זכוכית נטולות N-hydroxysuccinimide-derivatized, באמצעות מערך רובוטי ללא מגע (נפח טיפה ~900 pL). כל שקופית מכילה 4 בלוקים שונים של תת-מערכים (איור 1A, בצבעים) שחוזרים על עצמם 6 פעמים. כל תת-מערך נוצר על-ידי 112 נקודות גליקן שונות, כולל פקדים (8 שורות ×-14 עמודות) (איור 1B).
      הערה: מידע הקשור לגליקן מופיע בטבלה 1. ספריית הגליקן המשמשת להדפסת שבבים היא תוצאה של מאמץ סינתטי ארוך טווח של צוות IBCh; דוגמאות לסינתזה מתוארות בפרסומים קשורים. ספריית הגליקן כללה אנטיגנים של קבוצות דם וכמה מהאוליגוסכרידים הסופניים הנפוצים ביותר, כמו גם מוטיבים מרכזיים של גליקופרוטאינים וגליקוליפידים הקשורים ל-N ו-O של יונקים, אנטיגנים של פחמימות הקשורות לגידולים ורב-סוכרים מחיידקים פתוגניים.
   2. יש לדגור על המגלשות בקופסת לחות (לחות יחסית ~70%) בטמפרטורת החדר (25°C) למשך שעה אחת.
   3. מיקרו-מערכים חוסמים: יש לדגור על המגלשות למשך שעה וחצי עם חיץ חוסם בטמפרטורת החדר (100 מילימול חומצה בורית, 25 מ"מ אתנולמין, 0.2% (v/v) טווין-20 במים אולטרה-טהורים).
   4. לשטוף את glycochip עם מים טהורים במיוחד ולייבש אותו באוויר.
2. בקרת איכות Glycochip
   1. נתח שני מיקרו-מערכים מכל אצווה באמצעות תמיסה של 1mg/mL של הכנת אימונוגלובולינים מורכבים (CIP, המכילה אימונוגלובולינים: IgG, IgM ו-IgA), תמיסה של 10 מיקרוגרם/מ"ל של אימונוגלובולינים אנטי-אנושיים של עזים ביוטינילציה כנוגדן משני (IgM + IgG + IgA), ואחריו תמיסה של 1 מיקרוגרם/מ"ל של צימוד סטרפטאבידין פלואורסצנטי מתאים (באמצעות פרוטוקול המתואר להלן, ראה שלב 2).
   2. סרוק ונתח את הגליקוצ'יפס (ראה שלב 3, ניתוח מערך גליקנים).
   3. השתמש באצוות microarray עם מתאם תוך ובין-שבבי גבוה מ- 0.9.

2. טכניקת מערך גליקן

1. הכינו את התמיסות המימיות הבאות (במים טהורים במיוחד) ואחסנו אותן בטמפרטורת החדר (25°C):
   1. Buffer-1: אלבומין בסרום בקר (BSA) של 1% (w/v) במי מלח חוצצים פוספט (PBS), 1% (v/v) Tween-20 ו-0.01% (w/v) נתרן אזיד (NaN₃).
   2. Buffer-2: 1% (w/v) BSA ב-PBS, 0.1% (v/v) Tween-20 ו-0.01% (w/v) NaN₃.
   3. Buffer-3: 0.1% (v/v) Tween-20 ב-PBS.
   4. Buffer-4: 0.001% (v/v) Tween-20 ב-PBS.
2. Glycochip והכנת מדגם
   1. הניחו את קופסת האחסון עם המגלשות על השולחן עד שיגיעו לטמפרטורת החדר (25°C).
      הערה: השתמשו בכפפות לטקס ללא אבקה. glycochip חייב להיות מניפולציה על ידי החלק התחתון של שקופית זכוכית, שבו ברקוד ממוקם. הברקוד יעזור לך לזהות את הצד הימני, הימנעות מגע עם המשטח שבו גליקנים מודפסים.
   2. פתח את הקופסה, קח את הגליקוצ'יפ והנח אותו בתא הדגירה (25 מעלות צלזיוס), שכבר מותנה בנייר מסנן רטוב כדי לשמור על לחות קבועה בתוך התא.
   3. בינתיים, לדלל את סרום העכברים עם Buffer-1 (1:20) בצינורות 1.5 מ"ל. הומוגניזציה של תמיסת הסרום (5 שניות) עם מערבל מערבולת.
      הערה: הנפח הדרוש כדי לכסות משטח גליקוצ'יפ יחיד לחלוטין הוא כ 1 מ"ל.
   4. לאחר הומוגניזציה, לדגור את הסרום מדולל ב 37 °C במשך 10 דקות באמבט מים כדי למנוע הצטברות אימונוגלובולינים. צנטריפוגו את הצינורות למשך 3 דקות בטמפרטורה של 10,000 x גרם ו-25°C, אספו את הסופרנאטנט והשליכו כל חומר ששקע.
   5. מניחים את הגליקוצ'יפ בזהירות בתא הדגירה. לדגור אותו במשך 15 דקות ב 25 ° C עם 1 מ"ל של Buffer-3 כדי לחסל כל חומר שיורי על פני השטח של glycochip.
   6. החזיקו את הגליקוצ'יפ במצב אנכי ושטפו אותו מחדש עם כמה טיפות של Buffer-3 באמצעות פיפטת פסטר מפלסטיק. הסר בזהירות את החיץ ממשטח הגליקוצ'יפ באמצעות נייר סינון.

3. תגובה: נוגדנים נקשרים

1. מניחים את הגליקוצ'יפ בתא הדגירה. פזרו את דגימת הסרום המדולל על פני השטח של הגליקוצ'יפ באמצעות מיקרופיפטה. לדגור עם תסיסה מסלולית (30 סל"ד) ב 37 ° C במשך 1.5 שעות. ודא שכל האזור היבש של משטח הגליקוצ'יפ מכוסה על ידי דגימת הסרום המדוללת באמצעות קצה הפיפטה.
2. הסר כל דגימה עודפת וטבול את הגליקוצ'יפ למשך 5 דקות ב Buffer-3 ב 25 ° C. לאחר מכן, להעביר את glycochip למיכל עם Buffer-4 (5 דקות) ולבסוף לשטוף (5 דקות) את glycochip עם מים טהורים במיוחד. צנטריפוגה את glycochip במשך 1 דקות ב 175 x גרם ו 25 ° C כדי להסיר את הנוזל.

4. זיהוי: נוגדן משני

1. מניחים את הגליקוצ'יפ בתא הדגירה. מורחים על פני השטח של הגליקוצ'יפ תמיסה (5 מיקרוגרם/מ"ל) של אנטי-עכבר עיזים (IgG + IgM) מצומדת לביוטין ב-Buffer-2. לדגור עם תסיסה מסלולית (30 סל"ד) ב 37 ° C במשך 1 שעות.
2. הסר את החלק הלא מאוגד וחזור על שלבי הכביסה.
3. לאחר הצנטריפוגה, יש לדגור על הגליקוצ'יפ בחושך בטמפרטורה של 25°C למשך 45 דקות (30 סל"ד) עם 2 מיקרוגרם/מ"ל של תמיסת הסטרפטאבידין המתאימה עם תווית פלואורוכרום (ב-Buffer-2).
4. בחשיכה, הסירו את החלק הלא קשור וחזרו על שלבי הכביסה.
5. יבש את הגליקוצ'יפ באוויר.
   הערה: Glycochip יש לסרוק בהקדם האפשרי. אבל אם זה בלתי אפשרי לעשות סריקה מיד לאחר הצביעה, glycochips ניתן לאחסן במקום קריר ויבש בחושך.

3. ניתוח מערך גליקן

1. סרוק את המערך
   1. השאירו את הגליקוצ'יפ על השולחן עד שהוא מגיע לטמפרטורת החדר בחושך. במקביל, הפעל את סורק השקופיות ואת הלייזר (אורך גל עירור של 633 ננומטר).
   2. מחזיק את microarray, להחליק את glycochip לתוך החריץ עד שהוא נוגע בגב.
   3. סרוק את הגליקוצ'יפ ("הפעל סריקה קלה"), ושמור את הסריקה כ- ". קובץ TIFF.

טבלה 1: רשימת גליקנים, קשירתם לנוגדנים טבעיים במחזור הדם (IgM + IgG) של עכברי BALB/c (n = 20), המבוטאת ביחידות פלואורסצנטיות יחסיות (RFU) כחציון ± MAD, ומספר בעלי החיים החורגים מהחתך (≥4000 RFU). טבלה זו שוחזרה מ- Bello-Gil, D. et al. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

תוצאות

איור 1: ייצוג סכמטי (לא בקנה מידה גדול) של תצורה, הדפסה וניתוח של מערך גליקנים.(A) שבבים מודפסים מפותחים עם ספרייה של 419 מבנים גליקניים שונים, ולאחר מכן הזיהוי עם נוגדן משני מתאים המסומן פלואורסצנטית. כל שקופית מכילה 4 בלוקים שונים של תת-מערכים (בצבעים), החוזרים על עצמם 6 פעמים. כל תת-מערך נוצר על ידי 112 נקודות גליקן שונות (8 שורות × 14 עמודות), כולל פקדים. (B) דוג...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נוגדנים
איגי עז אנטי-אנושיים ביוטינילציה	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב (ארצות הברית)	מספר #: 31782
ביוטינילציה עז נגד עכבר IgM + IgG	תרמו פישר סיינטיפיק	מספר #: 31807
ציוד
מערך רובוטי sciFLEXARRAYER S5	Scienion AG, ברלין, גרמניה	http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
מגש כתמים (תא דגירה שקופיות)	Simport, Beloeil, QC, קנדה	מספר #: M920-2
צנטריפוגה	Eppendorf, Hamburg, גרמניה	מספר #: 5810 R
פיפטות	גילסון, מידלטון, ויסקונסין, ארה"ב (ארצות הברית)	http://www.gilson.com/en/Pipette/
סורק שקופיות	PerkinElmer, Waltham, MA, ארה"ב (ארצות הברית)	ScanArray GX Plus
טלטול אינקובטור	קול-פרמר, סטפורדשייר, בריטניה	מספר #: SI50
דגימות ביולוגיות
BALB/c עכברי סרה	מאמר זה	לא ישים
הכנת אימונוגלובולינים מורכבים (CIP)	Immuno-Gem, מוסקבה, רוסיה	http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
כימיקלים, ריאגנטים וגליקנים
ספריית גליקן	המכון לכימיה ביואורגנית (IBCh), מוסקבה, רוסיה	לא ישים
אלבומין בסרום בקר (BSA)	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי,	מספר #: A9418
אתנולמין	סיגמא-אולדריץ'	מספר #: 411000
טווין-20	Merck Chemicals & Life Science S.A., מדריד, ספרד	מספר #: 655204
מלח חוצץ פוספט (PBS)	VWR International Eurolab S.L, ברצלונה, ספרד	מספר #: E404
נתרן אזיד	סיגמא-אולדריץ'	מספר #: S2002
Streptavidin Alexa Fluor 555 מצומד	תרמו פישר סיינטיפיק	מספר #: S21381
Streptavidin Cy5 מצומד	GE Healthcare, ליטל צ'לפונט, בקינגהאמשייר, בריטניה	מספר #: PA45001
חומרים
N-hydroxysuccinimide-derivatized זכוכית שקופיות H	Schott-Nexterion, Jena, גרמניה	מספר #: 1070936
נייר סינון Whatman	סיגמא-אולדריץ'	מספר #: WHA10347509
צינורות 1.5 מ"ל	אפנדורף	מספר #: 0030120086
תוכנה ואלגוריתמים
מערכת ניתוח Microarray Express	פרקיןאלמר	http://www.per kinelmer.com/microarray