טכנולוגיית מיקרו-מערך פפטידי לפרופיל ספציפיות של נוגדנים

1. עיצוב פריסת שקופית המערך ולוח המקור

1. תחת הכותרת 'תכנן פריסת שקופיות' בממשק ArrayNinja, לחץ על הקישור המתאים למדפסת microarray בשימוש.
   הערה: ArrayNinja תוכנת לחקות את התנועה הרובוטית של שתי מדפסות microarray נפוצות (ראה טבלה 1). ניתן להגדיר תאימות עם המערכים האחרים על פי בקשה.
2. לחץ בתוך תיבת הדו-שיח 'טען לוחית', הקלד "ריק" ולחץ על 'Enter'. ראה איור 1 לצילום מסך של מודול העיצוב ArrayNinja.
3. כוונן את קוטר הספוט ל- 275 מיקרומטר ואת המרווח הנקודתי ל- 375 מיקרומטר. התאם את ההגדרות הנותרות (בלוקים של לוחות/שורת לוחות, שורות לוח כולל, עותקים משוכפלים, תכונות ב- y, Super Arrays, פאדג' SuperA; ראה איור 1) כדי להתאים אישית את האופן שבו התכונות יופיעו בשקופית microarray .
   הערה: קוטר הספוט נקבע על ידי גודל פין המיקרו-מערך. כאשר הגדרות אלה יותאמו, השקופית המצוירת תתעדכן בזמן אמת. השתמש בקריקטורה זו כדי להציג בתצוגה מקדימה כיצד כל הגדרה משנה את פריסת השקופית הסופית.
4. לאחר השלמת פריסת התכונות בשקופית, העבר את העכבר מעל כל תכונה ייחודית והזן את מזהה התכונה בתיבת הדו-שיח המוקפצת.
   הערה: מזהי תכונות יכולים להכיל מספרים, אותיות או שילובים. הדבר נדרש רק עבור תכונות ייחודיות, ותיבת דו-שיח לא תופיע בעת בחירת עותקים משוכפלים.
5. לאחר שלכל התכונות הייחודיות הוקצה מזהה, לחצו על 'אכלוס'. הזן שם עבור פריסת השקופית ולחץ על 'הדפס את הצלחת שלך' כדי לשמור. ייפתח דף חדש המציג את מספר לוחות המקור של 384 בארות הדרושות לייצור עיצוב השקופיות שנבחר וטבלה הממפה את המיקום הפיזי של כל תכונה שיש לטעון בלוחות המקור.
   הערה: זכור שם זה, כפי שהוא ישמש כדי לזכור עיצוב זה בעת ניתוח נתוני microarray . לחיצה על 'הדפס את הצלחת שלך' שומרת את הפריסה בתוך ArrayNinja.

2. ייצור מיקרו-מערכים

1. הכנת לוחית המקור
   1. השתמש במפה שנוצרה באמצעות ArrayNinja כדי ליצור את לוחות המקור של 384 בארות.
      הערה: תיאורים מפורטים של פפטידים שנשאלו בפלטפורמה זו ניתן למצוא במקום אחר.
   2. הפקד 1 - 2 מיקרוליטר מכל תכונה (למשל, פפטיד היסטון ביוטינילציה) לבאר הנכונה של לוחות המקור של 384 בארות.
      הערה: פפטידים של היסטון ביוטינילציה מופקדים בדרך כלל בין 200 - 400 מיקרומטר לתמיסות מלאי, אשר משוות לעודף מולארי של פי 10 עד פי 25 של הפפטיד לאתרי קישור סטרפטאבידין בנקודת מערך יחידה. זה מחושב באמצעות המשוואה:
      
      כאשר V הוא הנפח המועבר על ידי סיכה, [P] הוא ריכוז התכונה המודפסת, NA הוא המספר של אבוגדרו, ו-S הוא שטח הפנים של נקודה. C הוא כיסוי השקף, מבוטא כמספר מולקולות סטרפטאווידין ליחידת שטח כפול שלוש (המספר הממוצע של אתרי קישור סטרפטאווידין זמינים). V ו- C מתקבלים על ידי היצרן בהתאמה. תכונות אחרות עשויות לדרוש ריכוזים שונים בהתאם לגודל של ביומולקולה שבה צפיפות עשויה להיות דאגה. יש לבדוק אמפירית טווח של ריכוזי הדפסה עבור כל סוג חדש של תכונה כדי לקבוע את ריכוז ההדפסה האופטימלי.
   3. יש לדלל כל תכונה פי 10 עם מאגר הדפסה אחד בתוספת אלבומין 1% בסרום בקר (BSA). סובב את לוחות המקור במהירות של 500 x גרם למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: הכללת ביוטין עם תווית פלואורסצאין (5 מיקרוגרם/μL) במאגר ההדפסה מומלצת כבקרת איתור וככלי עזר חזותי כדי להקל על יישור נכון של המערך במהלך הניתוח (ראו איור 3).
2. פרוטוקול הדפסה (איור 2A – B).
   1. הכינו את המערך על ידי ריקון מיכל איסוף הפסולת ומילוי מיכל תמיסת השטיפה ומיכל מכשיר האדים במים מזוקקים סטריליים.
   2. הזן את הפרמטרים המשמשים לעיצוב השקופית ב- ArrayNinja (איור 1) בתוכנית בקרת המדפסת microarray.
   3. באמצעות תוכנית בקרת מדפסת microarray, הגדר את הליך הכביסה לכביסה של 1 s עם טבילה אחת. קבעו את ההגדרות שלאחר הכביסה כדי לטבול מחדש את הפינים 5 פעמים לאחר כל כביסה. הגדר את הלחות ל- 60%.
      הערה: תצורת הכביסה האופטימלית עשויה להשתנות בהתאם למדפסת microarray שבה נעשה שימוש. תצורת טבילת הפינים האופטימלית לאחר שטיפה עשויה להשתנות בהתאם למדפסת microarray שבה נעשה שימוש.
   4. הכניסו שקופיות פונקציונליות (למשל, זכוכית מצופה סטרפטווידין) ללוחות המצע והכניסו את כל הפלטות למעלית הפלטה. הכנס את לוחות המקור למחזיקי הלוחות והנח אותם במעלית לוחית המקור.
   5. לחצו על 'הדפס'. נטר את תהליך ההדפסה במשך כמה סבבים של שקיעת תכונות כדי לוודא שכל הגדרות הכביסה והטבילה נכונות. לאחר השלמת הפעלת ההדפסה, הסר את לוחות המצע מ- arrayer.
      הערה: כאשר ריצות הדפסה גדולות אוסרות על השלמת שלבי חסימה תוך יום אחד, ניתן לדגור שקופיות מודפסות בתא לח ב -4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. דוגרים על המגלשות ליד מים קטנה בתוך קופסת קרטון אטומה בניילון נצמד.
   6. חסום את המגלשות עם מאגר חוסם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב.
   7. שטפו את המגלשות 2 x 10 דקות בטמפרטורת החדר במי מלח חוצצים פוספט (PBS), pH 7.6 עם ערבוב. יבש את המגלשות על ידי סיבוב בצנטריפוגת שקופיות microarray למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר.
      הערה: לעיבוד מספר רב של שקופיות בבת אחת, ניתן להשתמש בתא שטיפת שקופיות במיקרוסקופ בתפוקה גבוהה, המאפשר לשטוף 50 שקופיות במקביל.
   8. עבור שקופיות המיועדות לחלוקה באמצעות שעווה, המשך לסעיף 2.1. עבור כל העיצובים האחרים, אחסנו מגלשות בטמפרטורה של 4°C המוגנות מפני אור ולחות.
      הערה: פפטידים מודפסים של היסטון ביוטינילציה יציבים למשך 6 חודשים לפחות כאשר הם מאוחסנים בדרך זו.

2. חלוקת שקופיות Microarray למחיצות

1. עט שעווה הידרופובי (איור 2C)
   1. מרחו שעווה על האזורים המכילים תכונות באמצעות עט שעווה. הניחו לשעווה להתייבש באוויר למשך 5 דקות לפני שתמשיכו לסעיף 3.
      הערה: לאחר החסימה, נקודות המערך יכולות להיות קשות מאוד לדמיון בעין. ניתן להדפיס את עיצוב השקופיות של ArrayNinja בקנה מידה ולהשתמש בו כמדריך למריחת שעווה.
2. אטם סיליקון (איור 2D)
   1. קלפו את הסרט השקוף מגבו של אטם המערך והניחו את צד הדבק כלפי מטה על מגלשת המיקרו-מערך.
   2. החזיקו את האטם במקומו למשך 5 שניות לפני שהמשיכו לסעיף 3.
3. טביעת שעווה (איור 2E)
   1. עבור שקופיות המיועדות לחלוקה באמצעות שעווה, הדפס שקופית בדיקה על זכוכית רגילה באמצעות 10% BSA. השתמש בשקופית בדיקה זו כדי למטב את מדריכי מדפסת השעווה או את הגדרות המערך, כדי להבטיח שכל התכונות יהיו בתוך תאי תבנית השעווה.
   2. מחממים את מדפסת השעווה microarray ל-85°C עד שכל השעווה נמסה לחלוטין, כ-30 דקות.
   3. הכנס את השקופית כשהצד המודפס פונה כלפי מטה ודחוף את השקופית עד לקו העזר הימני במדפסת microarray . משוך את הידית למעלה כדי להביא את התבנית במגע עם פני השטח של המגלשה. החזק עבור 2 s.
      הערה: ניתן לשנות את זמן האחיזה כדי להשיג עובי גבול שעווה אופטימלי.
   4. הסר במהירות את המגלשה ובדוק חזותית את גבולות השעווה כדי לוודא שכל הבארות סגורות ושהגבולות אינם עבים עד כדי כך שהם פולשים לכתמים. יש לאחסן מגלשות בטמפרטורה של 4°C המוגנות מפני לחות ואור.
      הערה: ניתן להגדיל או להקטין את זמן האחיזה כדי להשיג גבולות עבים או דקים יותר.

3. הכלאה של נוגדן היסטון PTM עם מיקרו-מערך פפטידי

1. הכינו חיץ הכלאה (PBS, pH 7.6, 5% BSA, 0.1% Tween-20).
2. אזנו את השקופית במאגר ההכלאה באמצעות כלי הכלאה. מכסים לחלוטין את כל המגלשה בחיץ הכלאה ודגרים במשך 30 דקות ב-4°C על שייקר מסלולי, במהירות נמוכה.
3. הכינו תמיסה המכילה נוגדן היסטון PTM מדולל במאגר הכלאה.
   הערה: בנתונים לדוגמה, גם נוגדן היסטון #1 וגם נוגדן #2 דוללו ביחס של 1:1,000 במאגר ההכלאה. טווח דילול דומה לזה המשמש לאימונובלוטינג מומלץ כנקודת מוצא.
4. דגרו על המערך עם תמיסת הנוגדנים למשך שעה אחת ב-4°C. הסר את תמיסת הנוגדנים ושטוף את המערך 3 פעמים למשך 5 דקות ב-4°C עם PBS קר, pH 7.6.
5. הכינו דילול בקנ"מ 1:5,000 - 1:10,000 של נוגדן משני מצומד בצבע פלואורסצנטי במאגר הכלאה.
6. יש לדגור על המערך עם תמיסת נוגדנים משנית למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C המוגנת מפני אור. הסר את תמיסת הנוגדנים המשנית ושטוף את מגלשת המיקרו-מערך 3 פעמים למשך 5 דקות ב-4°C עם PBS, pH 7.6. טבלו את המיקרו-מערך בצינור חרוטי של 50 מ"ל המכיל 0.1x PBS, pH 7.6 כדי להסיר עודפי מלח בטמפרטורת החדר. יבשו את המגלשה בצנטריפוגת מגלשה microarray בטמפרטורת החדר.
7. סרוק את השקופית באמצעות סורק microarray ברזולוציה של 25 מיקרומטר ומעלה, בהתאם לפרוטוקול הסריקה המומלץ של יצרן סורק המיקרו-מערך.
   הערה: אם קיים עוקב ביוטין עם תווית פלואורסצאין, סרוק הן את התעלה הירוקה (לדוגמה: 488 ננומטר, em: 509 ננומטר) והן את התעלה המתאימה לנוגדן משני מצומד בצבע פלואורסצנטי, בדרך כלל אדום (לדוגמה: 635 ננומטר, em: 677 ננומטר). מטרת הסריקה היא להשיג ערוצי יחיד .tif קבצים שניתן למזג לקובץ .png יחיד.

איור 1: מודול עיצוב ArrayNinja. צילום מסך של מודול העיצוב ArrayNinja מוצג בקו המקווקו. לוח הבקרה (למעלה) מציג את כל הפרמטרים שניתן לשנות במדפסת microaray. כאשר פרמטרים אלה מותאמים, התמונה המצוירת של פריסת השקופית (בפינה השמאלית התחתונה) מתעדכנת בזמן אמת. לאחר הגדרת הפריסה, המשתמש יכול לעבור עם העכבר מעל נקודות בודדות כדי להזין מזהי תכונות ייחודיים. ArrayNinja בונה ממשתמש זה קלט מפה של המיקום של כל תכונה בלוחות המקור (למטה מימין) הדרושים כדי לייצר פריסת שקופיות microarray שצוינה.

איור 2: ייצור מיקרו-מערך. (A) ייצור מיקרו-מערך פפטידי היסטון על שקופיות מיקרוסקופ מצופות סטרפטווידין באמצעות מדפסת מיקרו-מערך מגע. (B) מיקרו-מערכים המיוצרים עם 3 תת-מערכים של רשת 48 x 48 של תכונות פפטידיות. הפרדה של (C) 3 תת-מערכים עם עט שעווה הידרופובי, (D) 2 תת-מערכים עם דבק סיליקון, ו-(E) 48 תת-מערכים עם טביעת שעווה. כל המערכים המוצגים מיוצרים באמצעות שקופיות מיקרוסקופ בגודל 25 x 75 מ"מ.

איור 3: מודול ניתוח ArrayNinja. מוצג צילום מסך של מודול הניתוח ArrayNinja. לוח הבקרה (למעלה משמאל) מציג את כל הפרמטרים שניתן לכוונן כדי להציג באופן חזותי את המערך, למצוא כתמים וליישר רשת מעל תמונת המערך. ריחוף העכבר מעל תכונה מציג תצוגה מוגדלת (בפינה השמאלית העליונה) ומציג חלון מוקפץ המכיל את פרטי הזיהוי המשויכים לתכונה זו (למטה). נקודות התייחסות שנבחרו לתיקון רקע הן כתומות. תכונות שיש לא לכלול בניתוח במורד הזרם הן לבנות. ArrayNinja מכיל תכונת חיפוש מבוססת טקסט המדגישה תכונות תואמות בצהוב, כפי שמוצג בדוגמה עבור H4K16.