בדיקת ספיגת נוגדנים לאיתות חריץ הדמיה / DeltaD באבות גליה רדיאלית של דגי זברה

תקציר

מקור: Zhao, X. et al., בדיקת ספיגת נוגדנים למעקב אחר אנדוציטוזה חריץ / דלתא במהלך החלוקה הא-סימטרית של אבות גליה רדיאלית של דגי זברה.J. Vis. Exp. (2023)

סרטון זה מדגים בדיקת ספיגת נוגדנים לאיתות Notch/DeltaD באבות גליה רדיאלית של דגי זברה. היא כוללת הרכבה של עוברי דגי זברה דכוריוניים משובצים באגרוז, הזרקת תמיסת צבע המכוונת לליגנדות DeltaD על RGPs, והדמיה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לחלוקת תאים אסימטרית המאשרת את הפעלת האיתות Notch/DeltaD.

פרוטוקול

1. הכנת עוברים של דגי זברה

1. הציבו מכלי חציית דגים בשעות אחר הצהריים לפני השעה 17:00, עם נקבת דג בר אחת ודגי Tg זכר אחד [ef1a:Myr-Tdtomato] על ידי שימוש במחיצות כדי להפריד ביניהם בכל מכל מכל.
2. הסר את המחיצות לפני השעה 11:00 מכל מכלי המעבר למחרת בבוקר. שמור על שקט ואל תפריע לדגים בזמן שהם מזדווגים. ההשרצה מתרחשת בדרך כלל תוך 30 דקות לאחר הסרת החוצצים. הביציות המופרות נשארות בתחתית המיכל.
   1. לאסוף ביצים מופרות מן המיכלים עם מסנן רשת. מעבירים את הביציות על ידי שטיפתן לצלחת פטרי מלאה במי ביצים ובוחנים את העוברים תחת מיקרוסקופ מנתח בהגדלה של פי 10 עד פי 20.
3. העבירו את העוברים המופרים לפטרידית נקייה המכילה כ-20 מ"ל של תווך עובר (100 מ"ל של תמיסת מלאי 1,000x מכילה 29.4 גרם נתרן כלורי (NaCl), 1.27 גרם אשלגן כלורי (KCl), 4.85 גרם סידן כלורי, דיהידראט (CaCl_{2.2H 2}O) ו-8.13 גרם מגנזיום גופרתי הפטהידראט (MgSO_{4.7H 2}O)) עם פיפטות פסטר זכוכית גדולות משעממות. שמור את העוברים ב 28 ° C. שמור 50 עוברים מופרים לכל צלחת פטרי עם 30 מ"ל של עובר בינוני ב 28.5 ° C.
   הערה: זוג דגים אחד מייצר בדרך כלל 100-300 עוברים, ושיעור ההפריה וההישרדות של עוברים בריאים הוא מעל 95% עבור כל הזדווגות.
4. למחרת בבוקר, הוציאו את העוברים מהאינקובטור בשעה 8:00 בבוקר, כאשר העוברים הגיעו לשלב התפתחותי של ~18-20 שעות לאחר ההפריה (hpf). צפו בהם תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי בהגדלה של פי 20, תוך שימוש באור לבן בהתחלה. באותו זמן, עוברי דגי הזברה נמצאים בשלב 20-סומיט.
   1. השליכו עוברים מתים עכורים או קרועים מתחת למיקרוסקופ באמצעות פיפטה מזכוכית.
5. הפעל את מנורת הפלואורסצנט ובחר את הגדרת מסנן החלבון הפלואורסצנטי האדום (RFP) של המיקרוסקופ. לאחר מכן, בחר את העוברים עם פלואורסצנטיות אדומה חזקה ולהעביר אותם לצלחת חדשה עם מי ביצה.
   1. יש לנטרל את העוברים ידנית בעזרת שני מלקחיים עדינים (קצות המלקחיים צריכים להיות חדים ולא פגומים) תחת אור לבן (טבלת חומרים).
   2. החזיקו את הכוריון עם זוג מלקחיים אחד ועשו קרע בכוריון עם המלקחיים האחרים. פתח את הקרע בזהירות באמצעות המלקחיים, והפוך אותו גדול מספיק כדי שהעובר יעבור דרכו על ידי דחיפה עדינה של העובר עם קצות המלקחיים האחרים.
6. העבירו את העוברים המפרקים לצלחת פטרי חדשה עם מדיום עוברי טרי לשטיפה מהירה לפני מיקרו-הזרקה.

2. הכנת מיקרו-הזרקה

1. השתמש בנימים (קוטר חיצוני 1.2 מ"מ (OD), קוטר פנימי 0.9 מ"מ (ID), עם חוט להט) למשיכת מחטי הזרקה עדינות על מושך. תכנן וייעל את תוכנית המשיכה בהתאם למדריך.
2. פתח את קצה המחט עם מלקחיים תחת מיקרוסקופ דיסקציה סטריאו. הפוך את קוטר הקצה סביב 10 מיקרומטר ואת זווית התחדדות סביב 30°.
3. הצמד את הנוגדן החד-שבטי נגד Dld של העכבר עם האנטי-עכבר-IgG-Atto647N לפני ההזרקה.
   1. עבור כל ניסוי הזרקה, לערבב 0.5 μL של נוגדן anti-Dld (0.5 מ"ג / מ"ל) עם 2 μL של נוגדן נגד עכבר IgG-Atto647N (1 מ"ג / מ"ל) על ידי pipetting 5-10 פעמים. לאחר מכן, דגרו בטמפרטורת החדר לפחות 30 דקות (או על קרח במשך 2-3 שעות).
   2. לאחר הדגירה, יש להוסיף 2.5 μL של חיץ חוסם (10 מ"ג/מ"ל עכבר IgG) ו-0.5 μL של 0.5% פנול אדום לתערובת הנוגדנים ולפיפטה 10x כדי לערבב היטב כדי לחסום נוגדנים לא מצומדים שנותרו בתערובת.
      הערה: עבור כל ניסוי, הכינו תערובת אחת נוספת ללא נוגדן נגד Dld והשתמשו בה כבקרה.
4. הכינו אגרוז של 1% נקודת התכה נמוכה בתווך העוברי. מחממים את התערובת המכילה אגרוז ב-70°C עד שהתערובת הופכת לשקופה.
   1. Aliquot פתרון agarose ב 2 מ"ל צינורות microcentrifuge. שמור את aliquots בלוק חום ב ~ 40 ° C.
5. יש לשטוף את העובר בצינור המכיל 1% נקודת התכה נמוכה למשך 3 שניות.
6. הניחו את העובר על מכסה צלחת פטרי מפלסטיק הפוך יחד עם טיפות בודדות של אגרוז (~30-40 μL) כדי להרכיב כל עובר בנפרד על המכסה, כפי שמוצג באיור 1. הניחו את העוברים שטוחים לרוחב באגרוז ושמרו על תנוחה זו עד שהאגרוז התמצק בטמפרטורת החדר.
7. הר 12 עוברים בשלוש שורות אחד אחד כמו לעיל. מכסים את כל העוברים הרכובים באגרוז עם מדיום ביצית.

3. מיקרו-הזרקה

1. שים את העוברים המשובצים מתחת לסטריאומיקרוסקופ וכסה את האגרוז במי ביצה.
2. מקמו את מזרק לחץ האוויר יחד עם מיקרומניפולטורים, ומקמו אותם קרוב למיקרוסקופים כפי שמוצג באיור 1. השתמש בבלון גז הפלדה המכיל חנקן גזי (N₂) בלחץ גבוה כמשאב האוויר.
   1. פתח את שסתום הגז רק לאחר שהעוברים הותקנו באגרוז. לאחר מכן, טען מקדימה את מחט הזכוכית המוכנה עם 2 μL של תערובת נוגדנים על המיקרומניפולטור, כפי שמוצג באיור 1, בעת שימוש במודול המילוי הקדמי של המיקרו-מזרק.
   2. כוונן את לחץ הכניסה ל~80-90 psi, ואת לחץ ההזרקה ל~20 psi.
3. כיול נפח ההזרקה באמצעות מיקרומטר מתחת למיקרוסקופ, כפי שתואר קודם לכן. הגדר את משך זמן הכוונון להיות בין 10 אלפיות השנייה ל- 120 אלפיות השנייה, בהתאם לגודל פתח המחט. העבר כל פעימה של הזרקה על ידי הקשה על המשוט. כוונן את נפח ההזרקה של כל מסירה ל~ 4-5 nL.
4. יש לדחוף את קצה מחט המיקרו-הזרקה דרך לוחית הגג הגבית של המוח האחורי לנקודת הציר r0/r1, ולהזריק כ-10 nL (שתיים או שלוש פעימות) של תערובת נוגדנים מבלי לפגוע ברקמת המוח. שימו לב לזרימת הנוזלים האדומים בחדר המוח.
   הערה: חדר המוח האחורי הוא אחורי לגבול המוח האחורי של המוח האמצעי. תערובת הנוגדנים המוזרקת המכילה פנול אדום ממלאת את חדר המוח מהמוח האחורי למוח הקדמי באופן מיידי על ידי פיזור עם נוזל מוחי שדרתי.
5. לאחר ההזרקה, להסיר את קצה המחט מן העובר במהירות על ידי סיבוב הידית של micromanipulator. להזרקה מוצלחת, הצבע האדום של התערובת המוזרקת נשאר בחדר המוח ביציבות מבלי לדלוף לתוך האגרוז המוקף.
6. הזיזו את לוחית ההרכבה מתחת למיקרוסקופ כדי לאתר עובר רכוב אחר במיקום מתאים לחזרות.
   1. לאחר הזרקת שישה עד שמונה עוברים, מקלפים את האגרוז בסכין מיקרוכירורגית כדי לשחרר את העוברים מהאגרוז המשובץ. מעבירים את העוברים המוזרקים לצלחת טרייה עם 30 מ"ל של תווך עובר, ומניחים אותם בטמפרטורת החדר לשלבים הבאים.

4. הדמיה חיה של הרכבה וקיטועי זמן

1. לאחר 30 דקות, להעביר את העוברים שנבחרו ל 10 מ"ל של תווך העובר. הוסף 420 μL של מלאי טריקאין (4 מ"ג / מ"ל) ל 10 מ"ל של מדיום העובר כדי להרדים את העוברים.
2. כדי להרכיב את העוברים, להכין 0.8% נקודת התכה נמוכה agarose המכיל את אותו ריכוז של tricaine בצינור. שמור את aliquots בלוק חום ב ~ 40 ° C.
3. השתמש פיפטה זכוכית לטבול את העוברים המוזרקים באגרוז חם במשך 3 שניות. לאחר מכן, הוציאו מיד את העוברים מהאגרוז עם אותה פיפטה מזכוכית והניחו את העוברים במרכז צלחות תרבית תחתית זכוכית 35 מ"מ עם טיפת אגרוז מהשפופרת. הניחו על הכוס עובר אחד בלבד בכל טיפה.
4. כוונו את העוברים בעדינות עם בדיקת סיבים או קצה העמסה כדי לשמור על הצד הגבי של המוח העוברי קרוב ככל האפשר לתחתית הזכוכית. כוונן את תנוחת העובר בעדינות כדי להאריך את העובר מבלי לסלסל כאשר האגרוז מתמצק בהדרגה.
5. לאחר מכן, בדקו את מיקום העובר על ידי הפיכת צלחת תחתית הזכוכית. ודא כי כל המוח הקדמי הגבי עם עוברים רכובים כראוי ניתן לראות תחת המיקרוסקופ.
6. הוסף 2-3 מ"ל של 28.5 ° C מחומם מראש תווך עוברי המכיל tricaine כדי לכסות את העובר. הניחו את הצלחת כראוי על השלב מבוקר הטמפרטורה של המיקרוסקופ הקונפוקלי, כפי שמוצג באיור 1. כוונן את הטמפרטורה של תא ההדמיה להיות 28.5 ° C. העובר מוכן כעת להדמיה.

תוצאות

איור 1: תרשים זרימה של שלבי ניסוי.דגי זברה טרנסגניים המבטאים את כתב MyR-Tdtomato מוצלבים עם סוג בר AB ביום הראשון. ביום השני, עוברים פלואורסצנטיים אדומים נבחרים למיקרו-הזרקה, ולאחר מכן הדמיה בזמן. כל הניסוי ביום השני לוקח בערך 8 שעות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת תרבית תחתונה מזכוכית 35 מ"מ	תאגיד MatTek	P35GC-1.5-10-C
מזרק לחץ אוויר	נארישיגה	IM300
אנטי-עכבר-IgG-Atto647N	סיגמא-אולדריץ'	50185
CaCl2.2H2O	סיגמא-אולדריץ'	C3306
נימים, OD בגודל 1.2 מ"מ, ID, קוט זיהוי פנימי 0.9 מ"מ, עם חוט להט	מכשירים מדויקים בעולם	1B120F-6
דיסק מסתובב CSU-W1/שדה רחב במהירות גבוהה	ניקין	לא ישים	Nikon Ti מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם שדה ראייה גדול CSU-W1 קונפוקלי.
פינצטה רפואית Dumont דגם 5	תומאס סיינטיפיק	72877-D
מושך חום בוער P897	סאטר אינסטרומנטס	לא ישים	https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf
KCl	מיליפור	529552
MgSO4.7H2O	סיגמא-אולדריץ'	M2773
מיקרומניפולטורים	מכשירים מדויקים בעולם	WPI M3301R
עכבר נגד DLD	אבקאם	AB_1268496
מאגר חסימת IgG עכבר מבית Zenon	תרמופישר סיינטיפיק	Z25008
NaCl	סיגמא-אולדריץ'	S3014
פנול אדום	סיגמא-אולדריץ'	P0290
סטמי 2000	זיס	לא ישים
טריקאין	סיגמא-אולדריץ'	E10521
נקודת התכה נמוכה UltraPureTM אגרוז	Invitrogen	16520050