אימונולוקליזציה של חלבונים Arabinogalactan ו Pectins ברקמת הצמח

תקציר

מקור: Costa, M., et al. אימונולוקליזציה פלואורסצנטית של חלבוני אראבינוגלקטן ופקטינים בדופן התא של רקמות הצמח. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מדגים טכניקת צביעה חיסונית ללוקליזציה של חלבוני אראבינוגלקטן (AGPs) ופקטין ברקמות צמחים. חלקי רקמת צמח קבועים ומשובצים שרף מוכתמים בנוגדנים ראשוניים ומשניים פלואורסצנטיים ספציפיים ל-AGP ופקטין ובצבע פלואורסצנטי קושר תאית כדי לחשוף את הקולוקליזציה הספציפית לרקמה שלהם בדופן התא.

פרוטוקול

1. אימונולוקליזציה

הערה: הליך האימונולוקליזציה הפלואורסצנטית מסתמך על שימוש רציף בשני נוגדנים. הנוגדן הראשוני מועלה כנגד אנטיגן מטרה ספציפי. הנוגדן המשני מועלה במיוחד כנגד הנוגדן הראשוני ובטכניקות פלואורסצנטיות מצומד לפלואורופור (FITC [fluorescein isothiocyanate] בפרוטוקול ספציפי זה). הנוגדן הראשוני ישמש לזיהוי אנטיגן המטרה בדגימה, והנוגדן המשני ישמש לסימון המיקום שבו הנוגדן הראשוני התחבר לדגימה לאחר שטיפת עודף הנוגדן הראשוני. בקרות הן חלק חשוב בבדיקה זו ויש לבצע אותן תמיד כדי להבטיח את דיוק התצפיות. באר אחת בשקופית צריכה להיות שמורה לשימוש כבקרה שלילית, שם ידלגו על הטיפול הראשוני בנוגדנים, ולכן אין לראות אות בסוף הניסוי. בקרה חיובית חייבת להיכלל בניסוי על ידי טיפול בבאר אחת עם נוגדן אשר התיוג כבר ידוע ובטוח. הבקרה החיובית משמשת לאישור יעילות תיוג הנוגדנים המשני ותנאי התגובה בעוד הבקרה השלילית בודקת את ספציפיות הנוגדנים המשניים.

1. הכינו תא דגירה על-ידי הנחת מגבות נייר לחות בתחתית קופסת קצות פיפטה ועטיפתה בנייר כסף (איור 1B-1E). הניחו את השקופיות בתא הדגירה.
2. פיפטה: טיפה של 50 מיקרוליטר לכל באר של 8 מ"מ של תמיסת חסימה (5% חלב יבש ללא שומן (w/v) במי מלח חוצצי פוספט 1 M [PBS]) ולדגור במשך 10 דקות. להסיר את הפתרון החוסם ולשטוף את כל הבארות פעמיים עם PBS במשך 10 דקות.
3. הכן את תמיסות הנוגדנים הראשוניות (ראה טבלה 1), נוגדן 1:5 (v/v) בתמיסת חסימה; בצע הערכה של כ- 40 μL לכל 8 מ"מ באר.
   הערה: יש להתאים את ריכוז הנוגדן בהתאם לפרוטוקול היצרן.
4. בצעו שטיפה סופית במים מזוקקים פעמיים (ddH₂O) במשך 5 דקות, לעולם אל תתנו לבארות להתייבש לחלוטין.
5. פיפטה, פתרון הנוגדנים העיקרי לבארות התגובה. פתרון חסימת פיפטה לבארות הבקרה.
6. סגור את תא הדגירה ותן לעמוד במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר ואחריו לילה ב 4 ° C. להכין את תמיסת נוגדנים משנית, 1% בתמיסת חוסם (v/v) על 40 μL לכל באר. שמור אותו מכוסה בנייר כסף.
7. שטפו את כל הבארות פעמיים עם PBS למשך 10 דקות, ולאחר מכן 10 דקות נוספות עם ddH₂O. ודאו שלא נראה זכר לתמיסת החסימה או לפיקדונות על הבארות.
8. פיפטה פתרון נוגדנים משני לכל הבארות. מעתה ואילך, הגן על המגלשות מפני אור.
9. דוגרים במשך 3-4 שעות בחושך בטמפרטורת החדר.
10. לשטוף את כל הבארות פעמיים במשך 10 דקות עם PBS ואחריו שטיפה נוספת של 10 דקות עם ddH₂O.
11. יש למרוח טיפת קלקופלור (בקנ"מ 1:10,000 (w/v) פלואורסצנטי בהיר יותר 28 ב-PBS) על כל באר. ללא שטיפה, יש למרוח טיפה של אמצעי הרכבה (ראו טבלת חומרים) על כל באר ולהניח מכסה (איור 2H).
12. התבוננו במיקרוסקופ פלואורסצנטי, המצויד בעדשות 10x/0.45, 20x/0.75, 40x/0.95 ו-100x/1.40, השתמשו במסנני UV (עבור כתם קלקופלור) ו-FITC, כדי לזהות את דופן התא ואת האימונולוקליזציה בהתאמה (איור 2I). השתמש באורכי הגל הבאים: עירור/פליטה (ננומטר) 358/461 עבור UV ו- 485/530 עבור FITC.
13. לתצוגה חזותית טובה יותר של התוצאות, חפפו את שתי התמונות עם ImageJ או דומה.

טבלה 1: רשימת נוגדנים חד-שבטיים שימושיים. הטבלה לעיל מייצגת דוגמה לנוגדנים זמינים, עם מידע על המטרות שלהם והיכן ניתן לרכוש אותם.

שם	זיקה	זמין ב
LM2	חלבון אראבינוגלקטן	Plant probes (לידס, בריטניה)
LM5	פקטינים
LM6	ארבינאן
LM7	הומוגלקטורונן
LM8	Xylogalacturonan
LM13	(1-5)-א-ל-ערבינן
LM14	חלבון אראבינוגלקטן
LM16	עיבוד Arabinan - RG-I
LM18	הומוגלקטורונן
LM19	הומוגלקטורונן
LM20	הומוגלקטורונן
LM26	גלקטן מסועף
LM30	חלבון אראבינוגלקטן
JIM5	נמוך methyl-esterified homogalacturonan	CCRC (ג'ורג'יה, ארה"ב)
JIM7	הומוגלקטורונן מתיל-אסטרי מאוד
JIM4	חלבון אראבינוגלקטן
JIM8	חלבון אראבינוגלקטן
JIM13	חלבון אראבינוגלקטן
JIM15	חלבון אראבינוגלקטן
JIM16	חלבון אראבינוגלקטן
JIM20	אקסטנסין
MAC207	חלבון אראבינוגלקטן

תוצאות

איור 1. (A) ייצוג סכמטי של רצף חיתוך הבלוקים להכנת הדגימה (בלוק צהוב) לחתך עם האולטרה-מיקרוטום. ראשית, כמוסת הג'לטין מוסרת (1). לאחר מכן הם נחתכים תחילה בזווית של 40° עד 45° לצידי הקפסולה באופן משיק למדגם (2), חיתוך שני נעשה ב 90° של הראשון (3) ואחריו שלישי (4) ורביעי בעקבות אותו כלל (5). משלב ראשון זה של החיתוך נובע מבנה בצורת פירמידה אשר הפסגה ממוקמת מעל המדגם. לבסוף, בעזרת להב חד מגולחים את הפסגה ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
8 בארות שקופיות תגובת זכוכית	מרינפלד	MARI1216750	ניתן להשתמש במותגים אחרים
נוגדנים מסוג IgG (מולקולת צמר) נגד חולדות – FITC מייצרים ב-GOAT	סיגמא-אולדריץ'	F6258
החלקות כיסוי, 24 מ"מ x 50 מ"מ	מרינפלד	MARI0100222	תלוש הכיסוי צריך לכסות את כל הבארות. ניתן להשתמש במותגים אחרים
ddH2O	נה	נה
אתנול מוחלט	נה	נה
בוהק ניאון 28	סיגמא-אולדריץ'	F-6259
חלב יבש ללא שומן	נסטלה	נה	כל חלב יבש ללא שומן הוא מספיק
תנור	נה	נה	תנור מעבדה גנרי
נוגדן חד-שבטי שנוצר על ידי חולדה	בדיקות צמחים	נה	מספר נוגדנים המזהים רכיבי דופן תא זמינים הן במרכז המחקר לפחמימות מורכבות (CCRC, אוניברסיטת ג'ורג'יה ארה"ב) והן בבדיקות צמחיות (מעבדת קיר התא פול נוקס, באוניברסיטת לידס בבריטניה). רשימה קצרה של כמה MABS נפוצים והיכן ניתן לרכוש אותם מוצגת בטבלה משלימה 1
מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי זקוף עם מסנני פלואורסצנטיות UV ו-FITC	Leica Mycrosistems	DMLb
תא Vaccum	נה	נה
משאבת Vaccum	נה	נה
Vectashield	vecta Labs	T-1000	ניתן להשתמש בנוגדי דהייה אחרים. אנא בדוק תאימות עם FITC ועם Fluorescente brightner 28. (הערה: עבור חלופה לא מסחרית, (ראה Jonhson et al 198218) ניתן לייצר מדיום אנטי-דהייה על ידי ערבוב 25 מ"ג/מ"ל של 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)אוקטן (DABCO) בגליצרול 9:1 (v/v) ל-1xPBS. כוונן את ה- pH ל- 8.6 עם HCl מדולל.)