שימוש בכריך ELISA כדי לקבוע את תכולת הגליקופרוטאין האימונוגני בחיסון

תקציר

מקור: Jallet, C. et al., In Vitro ELISA Test to Assessment Rabies Vaccine Potency.J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מציג בדיקת אימונוסורבנט עקיפה הקשורה לאנזים או בדיקת לכידת חיסון סנדוויץ' ELISA שנועדה להעריך את רמות הגליקופרוטאין האימונוגני בחיסונים. צלחת הבדיקה, המכילה נוגדנים ספציפיים לגליקופרוטאין, מודגרת עם דגימות חיסון בדילול סדרתי, כולל חיסוני ייחוס ובדיקה, ולאחר מכן immunoassay כדי לכמת את תכולת הגליקופרוטאין בחיסון הבדיקה.

פרוטוקול

1. אמצעי זהירות

הערה: שיטה זו ישימה הן לנגיף הכלבת החי (RABV) והן לחיסון מומת.

1. השתמש בנוהלי מעבדה ובטיחות נאותים.
2. יש ללבוש ציוד הגנה אישי (PPE) מתאים, כולל מעיל חד פעמי, כפפות, מסכות, משקפיים וכו'.
3. כאשר הנגיף החי הוא titrated, להשתמש בארון בטיחות ביולוגי סוג II.
   1. שקול כל חומר במגע עם הדגימות (ריאגנטים, פתרונות כביסה, וכו ') כחומר זיהומיות.
   2. טפל בחומר המזוהם על ידי טבילתו בתמיסת אקונומיקה (2,5% של נתרן היפוכלוריט) למשך 30 דקות לטיהור.
4. לטפל בכימיקלים בהתאם לנוהלי מעבדה טובים.

2. הכנה

1. השתמש בריאגנטים ברמה אנליטית במידת האפשר.
2. הכינו תמיסות טריות של חיץ הציפוי/חיץ הקרבונט, חיץ הפסיבציה, המדלל וחיץ הציטראט (טבלה 1), סננו דרך מסננים של 0.45 או 0.22 מיקרומטר ואחסנו בטמפרטורה של 4°C למשך יום אחד לפני השימוש כדי לשמור על טוהר אנליטי שלהם.
3. אפשר לריאגנטים להגיע לטמפרטורת החדר (+18 ° C עד +25 ° C) 30 דקות לפני השימוש והומוגניזציה על ידי ערבוב עדין לפני השימוש.

3. רגישות מיקרו-פלטה

הערה: השתמש ב-96 לוחות ספיחת היטב המותאמים לקשירת כמויות גבוהות של אימונוגלובולינים (למשל, ראה טבלת חומרים).

1. לכל באר, להוסיף 200 μL של נוגדן חד שבטי (mAb-D1) מדולל במאגר פחמתי.
   הערה: ריכוז אופטימלי של כ-1 מק"ג/מ"ל נקבע בניסוי ומתאים לדילול משוער של 1/2000 של mAb-D1 המטוהר. ריכוז מומלץ זה מצוין עבור כל אצווה mAb-D1 ויש לאמת אותו מעת לעת עם הבקרה החיובית.
2. מכסים את הצלחת בסרט דבק ודגרים על המיקרו-צלחת במשך 3 שעות בטמפרטורה של 37°C באווירה לחה.
3. בזהירות לשאוף ולהעביר את תוכן הבאר לתוך נמען המכיל 2,5% נתרן hypochlorite פתרון.
4. הפכו את צלחת המיקרו והניחו לה להתייבש על נייר סופג בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.

4. פסיבציה של Microplate

1. לכל באר, להוסיף 300 μL של חיץ פסיבציה.
2. מכסים את הצלחת בסרט דבק ודגרים במשך 30 דקות בחום של 37°C.
3. שאפו בזהירות והעבירו את תכולת הבאר לנמען המכיל 2,5% תמיסת נתרן היפוכלוריט.
4. הפכו את צלחת המיקרו והניחו לה להתייבש על נייר סופג בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת
   הערה: ניתן להשתמש במיקרו-צלחת באופן מיידי או לאחסן אותה אטומה בטמפרטורה של -20°C למשך עד 3 חודשים עד לשימוש.

5. בדיקת ELISA

הערה: לביסוס עקומת הבקרה של חיסון הייחוס, שלב 5.3 אינו נדרש; כדי לבצע טיטרציה של החיסון הנבדק יש צורך בכל השלבים 5.1 עד 5.6.

1. שטיפת צלחת המיקרו הרגישה
   1. לכל באר, להוסיף 300 μL של חיץ הכביסה.
   2. שאפו בזהירות והעבירו את תכולת הבאר לנמען המכיל 2,5% תמיסת נתרן היפוכלוריט.
   3. חזור על שלבים 5.1.1 ו- 5.1.2 חמש פעמים נוספות כדי לשטוף את הצלחת הרגישה באופן נרחב.
   4. הפוך את צלחת המיקרו ותן לה להתייבש על נייר סופג בטמפרטורת החדר במשך 1 דקות.
2. דילולים של חיסון הייחוס לעקומת הבקרה
   1. יש להרכיב מחדש את חיסון הייחוס (אנטיגן תיקוף לוט 09) ב-1 מ"ל מים מזוקקים המתאים לריכוז של 10 מיקרוגרם/מ"ל של גליקופרוטאין של נגיף הכלבת.
   2. הכינו דילול פי עשרה של חיסון הייחוס המשוחזר במדלל כדי להגיע ל -1 מיקרוגרם / מ"ל של גליקופרוטאין וירוס הכלבת.
   3. הכינו 6 דילולים סדרתיים כפולים של חיסון ייחוס זה במדלל כמצוין בטבלה 1.
   4. מפזרים 200 μL של המדלל בכפילות (בארות 1H/2H) כדי לשמש כבקרה ריקה.
   5. להפיץ 200 μL לכל באר של כל דילול חיסון ייחוס כפול (בארות G1/G2 עד A1/A2).
3. דילולים של החיסון הנבדק לטיטרציה שלו
   1. הכינו דילול פי עשרה של החיסון הנבדק במדלל.
   2. הכינו 7 דילולים סדרתיים כפולים של החיסון הנבדק בדילול כמצוין בטבלה 2.
   3. יש להפיץ 200 מיקרוליטר לכל באר של כל דילול חיסון שנבדק בכפילות (בארות H3/H4 עד A3/A4).
4. דגירה/שטיפה של צלחת ELISA
   1. מכסים את צלחת המיקרו בסרט דבק ודגרים במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.
   2. הסר את הסרט, שאפו בזהירות והעבירו את התוכן של כל באר לנמען המכיל 2,5% תמיסת נתרן היפוכלוריט.
   3. לכל באר, להוסיף 300 μL של חיץ כביסה.
   4. שאפו בזהירות והעבירו את התוכן של כל באר לנמען המכיל 2,5% תמיסת נתרן היפוכלוריט.
   5. חזור על שלבים 5.4.3 ו- 5.4.4 חמש פעמים כדי להסיר את האנטיגן הלא מאוגד ולשמר את טרימרים חלבון G הקשורים לנוגדן המצופה (mAb D1).
   6. הפכו את צלחת המיקרו והניחו לה להתייבש על נייר סופג בטמפרטורת החדר למשך דקה.
5. קשירה של mAb-D1 מצומד peroxidase
   1. יש לפזר 200 μL לכל באר של הדילול המומלץ (1/2000) של mAb-D1 המסומן בפרוקסידז בדילול (ריכוז משוער של 1μg/mL). ריכוז מומלץ מצוין עבור כל אצווה mAb-D1 ויש לאמת אותו מעת לעת עם הבקרה החיובית.
   2. מכסים את צלחת המיקרו בסרט דבק ודגרים במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.
   3. הסר את הסרט, שאפו בזהירות והעבירו את התוכן של כל באר לנמען המכיל 2,5% תמיסת נתרן היפוכלוריט.
   4. מוסיפים לכל באר, 300 μL של חיץ הכביסה.
   5. שאפו בזהירות והעבירו את התוכן של כל באר לנמען המכיל 2,5% תמיסת נתרן היפוכלוריט.
   6. חזור על שלבים 5.5.4 ו- 5.5.5 חמש פעמים כדי להסיר נוגדן לא קשור המסומן בפרוקסידז (mAb D1).
   7. הפכו את צלחת המיקרו והניחו לה להתייבש על נייר סופג בטמפרטורת החדר למשך דקה.
6. התגלות באמצעות כרומוגן-מצע
   1. פיזור 200 μL לכל באר של תמיסת כרומוגן-מצע.
   2. אוטמים את צלחת המיקרו עם סרט ודגרים בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. מתפתח צבע צהוב-כתום שעוצמתו פרופורציונלית לכמות נוגדנים קשורים המסומנים בפרוקסידז (mAb D1).
   3. עצור את התגובה על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של תמיסה עוצרת לכל באר.
   4. נגב בזהירות את תחתית צלחת המיקרו והנח אותה בספקטרופוטומטר כדי לקבוע את הצפיפות האופטית (OD) ב 492 ננומטר של כל הבארות בשימוש: בקרה שלילית (ריקה), חיסון ייחוס וחיסון נבדק.
   5. אסוף נתוני OD בתבנית קובץ .xls או .xlsx לצורך ניתוח.

טבלה 1. חוצצים המשמשים בבדיקה.

מאגרים וריאגנטים	הכנה
חיץ ציפוי (חיץ קרבונט 50mM pH=9.6)	הוסף נתרן פחמתי 50 mM (Na2CO 3-10H 2O) לסודיום ביקרבונט 50 mM (NaHCO3) עד pH הרצוי (כ 1/10 נפח של סודיום ביקרבונט)
חיץ פסיבציה	0.3% אלבומין בסרום בקר (BSA, חלק V), 5% סוכרוז במאגר פחמתי 50 mM pH 9.6
10x פוספט חוצץ מלוחים pH=7 (PBS 10x)	NaCl 80 גרם, KCl 2 גרם, Na2PO 4-12H 2O 11.33 גרם, KH2PO4 2g ב 1L מים מזוקקים. כוונן pH=7 עם 4N NaOH
חיץ כביסה	0.05% טווין ב 1x PBS
מדלל	0.5% אלבומין בסרום בקר (חלק V), 0.05% טווין ב-1x PBS (התאמת pH ל-7 בגלל החמצה על ידי BSA)
מאגר ציטראט pH-5.6 (למצע פרוקסידז)	11.67 גרם Tri-sodium citrate-2H2O (Na3C6H5O 7-2H20), 2.17 גרם חומצת לימון-1H20 בליטר מים מזוקקים
תמיסת מצע-כרומוגן	50 מ"ג טבלית דיאמין אורתו-פנילן, 0.1% מי חמצן 30% (110 כרכים) ב-25 מ"ל חוצץ ציטראט pH 5.6
פתרון עצירה (4N חומצה גופרתית)	10 מ"ל H2SO4 36N ב-80 מ"ל מים מזוקקים מקוררים. דילול חייב להתבצע באמבט קרח

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ארון בטיחות ביולוגי סוג II	תרמופישר סיינטיפיק	10445753	אם טיטרציה וירוס חי
צלחות אימונו לא סטריליות שקופות בעלות תחתית שטוחה 96 באר, 400 μL, MAXISORP	תרמופישר סיינטיפיק	439454	טוב להיקשרות לנוגדן הטעון
לצייד Labo פוליפרופילן מעבדה אדים אדים	תרמופישר סיינטיפיק	12576606	להכנת חומצה גופרתית
צלחת אימונולוגיה חזק ספיחה MAXISORP שטוח תחתון ובכן F96	דוטשר	55303	טוב להיקשרות לנוגדן הטעון
סרט איטום Microplate(100 גיליונות)	תרמופישר סיינטיפיק	15036
קורא Microplate במצב יחיד זריחה	טקאן
מיקרופלייט שייקר-אינקובטור	דוטשר	441504
מכונת כביסה Microplate Wellwash	תרמופישר סיינטיפיק	5165000
פיפטה רב ערוצית (30-300 μL) 12 ערוצים	תרמופישר סיינטיפיק	4661180N
פיפטות חד-ערוציות (ערכה 2: Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL &; 100-1000 μL)	תרמופישר סיינטיפיק	4700880