מערכת זיהוי מבוססת מחסניות מיקרופלואידיות עבור אימונוגלובולין E ספציפי לאלרגן

תקציר

מקור: Huang, Z., et al. יישום טכנולוגיה מיקרופלואידית של Biochip לזיהוי אימונוגלובולין E ספציפי לאלרגן בסרום (sIgE).J. Vis. Exp.(2019)

סרטון זה מדגים פרוטוקול לזיהוי אימונוגלובולין E ספציפי לסרום באמצעות מערכת כימילומינסנציה מבוססת מחסניות מיקרופלואידיות. סרום IgEs אינטראקציה עם אלרגנים שונים משותקים באזור התגובה של המחסנית, אשר מזוהים לאחר מכן עם נוגדנים מצומדים peroxidase anti-IgE ומצע chemiluminescent, המאפשר זיהוי בו זמנית של IgEs ספציפיים לאלרגנים מרובים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. מידע בסיסי של קבוצת המחקר

הערה: מאגר המידע על אלרגיה של מעבדת המפתח הממלכתית למחלות נשימה (AIR-SKLRD) הוא בנק נסיוב גדול שהוקם בתוך מכון גואנגזו לבית החולים לנשימה (GIRH). AIR-SKLRD, שהחל לפעול בעשור האחרון, כבר החל לאסוף ולאחסן דגימות נסיוב מחולים עם מחלות אלרגיות ואת המידע הקליני שלהם (טבלה 1). המחקר הנוכחי בוצע עם סרה מה-AIR-SKLRD.

1. חפש במסד הנתונים של AIR-SKLRD סרה שנאספו מינואר 2015 עד יוני 2018 ובחר את החולים במחלה אלרגית שנמצאו רגישים לאלרגנים הנפוצים באזור.
2. ודא כי כל החולים שנבחרו סובלים ממחלות אלרגיות, כגון נזלת אלרגית או אסטמה, דרמטיטיס אלרגית ו / או אורטיקריה, וכי הסרום של חולים אלה מכיל רגישות אימונוגלובולין E ספציפית לאלרגן בסרום מרובים (sIgE) של אלרגנים נפוצים באזור זה, שזוהו על ידי מערכת 1.
3. לא לכלול מטופלים עם רשומות רפואיות חלקיות, אלה שאבדו לצורך מעקב, אלה המסרבים לתת הסכמה מדעת לגבי השימוש בדגימות הסרום שלהם למטרות מדעיות, אלה עם כשל חיסוני מזוהה, אלה המטופלים כעת באימונותרפיה או בחומרים אימונומודולטוריים, או אלה שנמצאו עם זיהומים טפיליים.
4. יש לוודא שלא ניתן טיפול או מרשם לתרופה לפני איסוף הסרום כדי למזער את ההפרעה לממצאי המעבדה. כל דגימות הסרום שלא עמדו בקריטריונים נדחו.

2. זרימת המחקר ומדידות העניין

הערה: המערכת המיקרופלואידית זקוקה ל-100 מיקרוליטר של סרום כדי לקבוע 19 אלרגנים. דם ורידי (5 מ"ל) נאסף מכל חולה באמצעות כלי דם ואקום המכיל ג'ל הפרדה. לאחר צנטריפוגה של 10 דקות במהירות של 1,000 x גרם, השכבה העליונה נאספה לבדיקה. סרום שאינו בשימוש אוחסן ב -80 מעלות צלזיוס. לפני הבדיקה, הסרום נשמר בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות ונער עם מערבל מערבולת. מחזורי הקפאה והפשרה חוזרים ונשנים נמנעו.

1. בדקו בעיקר את דגימות הסרום לאיתור sIgEs לאלרגנים שלמים של Dermatophagoides pteronyssinus (d1), Dermatophagoides farinae (d2), Blomia tropicalis (d201), קשקשים של חתולים (e1), קשקשים של כלבים (e5), עשב ברמודה (g2), טימותי גראס (g6), תיקנים (i6), Aspergillus fumigatus (m3), קנדידה אלביקנס(m5), אמברוסיה (W1), חלבון ביצה (F1), חלב (F2), חיטה (F4), בוטנים (F13), סויה (F14), שקדים (F20), סרטנים (F23) ושרימפס (F24). בצע את ההוראות המפורטות בסעיף 3.
   הערה: קביעת sIgE נעשתה באמצעות ערכת בדיקת IgE ספציפית לאלרגן (ראה טבלת חומרים) ונמדדה על ידי מנתח כימילומינסנציה.
2. בחר באופן אקראי שלוש דגימות מבין הדגימות עם מספיק סרום (לפחות 900 μL) למחקר שחזור. שמירה על כל התנאים ללא שינוי, למדוד את שלושת sera עבור sIgEs אלרגן מדי יום במשך 9 ימים רצופים (כלומר, 100 x 9 = 900 μL של סרום).

3. הליך בדיקת אוטומציה למחצה של המערכת המיקרופלואידית

הערה: מערכת 2 משלבת טכנולוגיה מיקרופלואידית אוטומטית, מיקרו-מערך חלבונים, ניתוח אור קר, ניתוח IgE מקבילי וטכנולוגיית עיבוד תמונה. פרוטוקול הבדיקה מחולק לארבעה חלקים: הכנת הציוד, העמסת דגימה, דגירה ומדידה.

1. הכנת הציוד
   1. הפעל את המחשב ואת המנתח power.
      הערה: מתג ההפעלה נמצא בצד שמאל של הבסיס.
   2. הפעל את תוכנית LabIT במחשב. אם חלון האזהרה של 'מסגרת כהה' מופיע, לחצו על 'אישור' כדי להפעיל את בדיקת הדליפה. לאחר מכן, לחץ על הלוגו המרכזי כדי להיכנס לממשק הפעולה.
      הערה: המערכת תזכיר למשתמש להפעיל את בדיקת הדליפה אם אינה פעילה במשך יותר מ-24 שעות.
   3. בדוק את טמפ' התגובה ואת טמפ' CCD (התקן מצומד טעינה) בפינה הימנית התחתונה של המסך. טמפרטורת התגובה צריכה לעלות ל -37 ° C ± 1 °C (75 °F) בתוך כ -10 דקות, ואת טמפ CCD צריך לרדת ל -15 °C ± 1 °C (75 °F).
   4. הפעל את בדיקת הדליפה לאחר שטמפ 'CCD ירד ל -15 ° C ± 1 ° C. לפני ביצוע בדיקת LEAK, ודא שלא נותרו פריטים אחרים בתוך המכשיר וסגור את הדלת. כלי לחיצה | בדיקת מערכת | בדיקת דליפה. אין לפתוח את הדלת במהלך הבדיקה. בסיום הבדיקה, חלון הדוח יופיע.
2. טעינה לדוגמה
   1. הוסף 620 μL של חיץ שטיפה, 120 μL של חיץ חוסם, 60 μL של מצומדים A ו- B, 60 μL של מצע A ו- B, ו- 100 μL של דגימות סרום למיכל מגיב המתאים על מחסנית microfluidic.
3. דגירה
   1. לחץ על מזהה מחסנית, השתמש בסורק הברקוד כדי לסרוק את המספר הסידורי של המחסנית, הזן את מזהה הדגימה, הכנס את המחסנית למנתח, סגור את הדלת ולחץ על מנתח והפעל כדי להתחיל בניתוח.
4. מדידה
   1. יצא את התוצאות לתוכנה סטטיסטית (לדוגמה, Excel) לאחר המדידה.
      הערה: לאחר 30 דקות של דגירה, המנתח מבצע באופן אוטומטי את המדידה ומדווח על התוצאה.

טבלה 1: מאפיינים דמוגרפיים של מטופלים. בסך הכל נמצאו 293 נבדקים שעמדו בתנאי ההכללה, עם גיל חציוני של 23 (טווח בין-רבעוני בין 8 ל-36 שנים). מתוכם, 170 (58.02%) היו גברים ו-123 (41.98%) היו נשים. כמו כן, 92 (31.40%) מהם סבלו מנזלת אלרגית, 117 (39.93%) סבלו מאסתמה אלרגית, 36 (12.29%) סבלו מתחלואה נלווית של נזלת ואסתמה, ו-48 (16.38%) סבלו ממחלות אלרגיות אחרות, כגון אלרגיה למזון או אלרגיות עור.

תכונה	לא( %)
מין, n(%)
נקבה	123(41.98%)
זכר	170(58.02%)
גיל, שנה, n(%)
חציון (25%,75%)	23(8,36)
≤10	97 (33.11%)
11-20	37(12.63%)
21-40	101(34.47%)
>41	58(19.80%)
אבחון, n(%)
נזלת אלרגית	92 (31.40%)
אסתמה אלרגית	117(39.93%)
נזלת אלרגית עם אסתמה	36(12.29%)
אחרים	48 (16.38%)

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Agnitio BioIC אנלייזר	Agnitio Science & Technology (טיוואן, סין)	BA-G2000
ערכת זיהוי IgE ספציפית לאלרגנים של BioIC	Agnitio Science & Technology (טיוואן, סין)	DR17A12
צלחת מיקום BioIC Cartrideg	Agnitio Science & Technology (טיוואן, סין)	T20SET
מתקן מגיב BioIC	Agnitio Science & Technology (טיוואן, סין)	DS-1
תמונה מכונת ברקוד דו מימדית	Agnitio Science & Technology (טיוואן, סין)	NLS-HR200
מערבולת מערבולת VORTEX-5	Haimen Kylinbell מעבדה Lastruments ושות', בע מ	וורטקס-5