$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. צימוד של ננו-חלקיקים מגנטיים (MNPs)
- השתמש בהליך צימוד מסחרי וריאגנטים כדי להתאים MNPs עם נוגדנים (ABS) (בדרך כלל 1 מ"ג). ננו-חלקיקים של תחמוצת ברזל עם חומצה קרבוקסילית כקבוצות תגובתיות משמשים.
- אם הנוגדנים נמצאים בנפח גבוה מ-0.5 מ"ל, יש להתרכז באמצעות רכז 100K. סבבו במהירות של 2,000 x גרם במשך 3-5 דקות.
- בסוף ההליך, לאחר הוספת 10 μl של חיץ מרווה, להעביר MNPs לצינור 12 מ"מ x 75 מ"מ ולהוסיף 3 מ"ל חיץ כביסה/אחסון. הניחו את הצינור בחור המרכזי של מפריד מגנטי והשאירו למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
- ודא כי MNPs נאספו כולם לצד הצינור, ולאחר מכן בזהירות צינור החוצה את כל הנוזלים. הוסיפו 3 מ"ל של חיץ כביסה/אחסון טרי והחזירו למגנט.
- לאחר מספר שעות, בדוק אם MNPs נאספים לצד הצינור ולאחר מכן צינור את הנוזל. יש להשתמש ב-2 מ"ל של מאגר כביסה/אחסון כדי להשעות מחדש את ה-MNPs ולאחסן בטמפרטורה של 4°C.
- ודא ששרירי הבטן מצומדים ל-MNPs על-ידי תיוג שלהם עם מקטע נוגדן Fab פלואורסצנטי רלוונטי (לדוגמה, אנטי-עכבר עז אם אתה משתמש בעכבר חד-שבטי Ab ללכידה כמתואר בסעיף 2) והפעל על ציטומטר זרימה.
2. תיוג נוגדנים המוצמדים ל-MNPs
- ערבבו 60 μl (3.9 x 1012 חלקיקים) של MNPs (לכל מצב) ו-5 μl (של תמיסה מסחרית של 200 מיקרוגרם/מ"ל) המסומנים כמקטעי Fab, ספציפיים לאיזוטיפ של לכידת Ab בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
- יש לדגור בטמפרטורת החדר (RT) במשך 30 דקות עם ערבוב רציף.
- הרטיבו מראש רכז 100K עם 300 μl של מלח חוצץ פוספט (PBS) וסחררו במיקרוצנטריפוגה במהירות של 1,500 x גרם למשך 5 דקות.
- מטהר קומפלקסים מסומנים בעמודת 100K. סובבו את התערובת משלב 2.2 במיקרו-צנטריפוגה במהירות של 1,500 x גרם במשך 5 דקות, שטפו עם PBS של 200 μl והתאוששו בנפח התחלתי.
3. שימוש בקומפלקסים מסומנים של Ab-MNP כדי ללכוד חלקיקים מעניינים (שלפוחיות חוץ-תאיות, EVs)
- יש לדגור על MNPs מסומנים מראש 60 μl (3.9 x 1012 חלקיקים) עם הכנת EV (100 μl).
- הכינו תכשירים לרכב חשמלי בשיטות שונות. כאן, לטהר EVs על שיפועים סוכרוז, לאסוף אותם פלזמה ענייה טסיות באמצעות ריאגנטים משקעים exosome או לבודד ישירות פלזמה.
הערה: יש לקבוע יחסים אופטימליים לכל ניסוי והם תלויים בריכוז הרכב החשמלי בהכנה. מקטע MNP-Ab צריך להיות ~ 106 עודף בהשוואה לריכוז של חלק EV.
- יש לדגור שעה אחת בטמפרטורה של 4°C עבור כלי רכב חשמליים.
- הוסף 2.5% IgG עכבר / IgG אנושי כדי לחסום קשירת Fc, מערבולת עדינה, לדגור 3-5 דקות ב RT.
- הוסף ריכוזים מומלצים או מצופים על-ידי היצרן של כל ABS לגילוי ודגור 20 דקות נוספות ב-RT.
4. הפרדת כלי הרכב החשמליים שנלכדו ב-MNP מנוגדנים לא מאוגדים באמצעות עמודים מגנטיים
- הכינו עמוד הפרדה מגנטית לשימוש על ידי הצבתו במגנט מפריד.
- הרטיבו מראש את העמוד עם 500 מיקרוליטר של חיץ כביסה (2 מ"מ חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA), 0.5% אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-PBS). אפשרו למאגר הכביסה לזרום דרך העמוד.
- הוסף את מתחמי MNP-EV לעמודה ואפשר לכל הנוזל לזרום דרכם. הוסף 500 μl של חיץ כביסה לעמודה, ואפשר לכל הנפח לעבור.
- יש לחזור על הכביסה עם חיץ הכביסה פעמיים נוספות.
- הסר את העמוד מהמגנט והנח בצינור 12 מ"מ x 75 מ"מ לאיסוף מתחמי MNP-EV שנשמרו. תנו לעמוד בצינור מחוץ למגנט למשך 3 דקות. הוסף 200 μl של PBS ותן לחרוזים לזרום למטה על ידי כוח הכבידה, להוסיף עוד 200 μl של PBS, ולתקן עם 200 μl 4% paraformaldehyde לאחר elution.
הערה: Paraformaldehyde הוא חומר החשוד כמסרטן ויש לטפל בו במכסה מנוע מאוורר וללבוש כפפות.
- כדי לכמת כלי רכב חשמליים בודדים, השתמש בהגדרות נפחיות ב- High Throughput Sampler (HTS) או ממש לפני הרכישה, הוסף חרוזי ספירת ציטומטריה של זרימה מעורבת היטב.
5. ניתוח של כלי רכב חשמליים שנלכדו על ידי MNPs באמצעות ציטומטר זרימה
- חיממו את ציטומטר הזרימה למשך 30 דקות.
- הפעל חרוזי בקרת איכות.
- הגדר סף פלואורסצנטיות של MNPs או של כלי רכב חשמליים מסומנים. השתמש PBS מסונן 0.22 מיקרומטר עבור סף כדי להפחית את "רעש" הרקע. הגדר את הסף על-ידי התאמת מתח PMT לרמה שבה PBS מסונן אינו נותן אירועים, או מעט מאוד.
- הפעל דוגמאות במצב נמוך. (השתמש במסנן מוטבע נוסף של 0.04 מיקרומטר עבור נוזל נדן הממוקם בסדרות מאחורי מסנן המעטפת הסטנדרטי של 0.2 מיקרומטר כדי למנוע עוד יותר אירועים שגויים).