$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנת דגימה ביולוגית
הערה: האתר האנטומי שנבחר ונפח איסוף הדם נותרים לשיקול דעתו של כל חוקר בנפרד ולא ישפיעו על תוצאת הבדיקה. עם זאת, לאחר קבלתן, יש לטפל בדגימות בהתאם לשלבים המפורטים להלן.
- הכנת דגימות סרום
- אספו את נפח הדם הרצוי לתוך צינור האיסוף המועדף ואפשרו לו להיקרש במשך 30 דקות לפחות.
- צנטריפוגה את הדגימה במשך 10 דקות ב 1,000 x גרם בטמפרטורת החדר.
- הסר את הסרום ואת הבדיקה מיד או aliquot לתוך פוליפרופילן microcentrifuge tubes ולאחסן דגימות ב ≤ -20 ° C.
- הכנת דגימות פלזמה
- יש לאסוף את נפח הדם הרצוי באמצעות צינורות איסוף דם מצופים בחומצה אתילאנדיאמין טטראצטית (EDTA).
- צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 1,000 x גרם בטמפרטורת החדר תוך 30 דקות מהאיסוף.
- הסר פלזמה לבדוק מיד, או aliquot לתוך צינורות microcentrifuge פוליפרופילן ולאחסן דגימות ב ≤ -20 °C.
- הכנת דגימות סופרנטנט לתרבית רקמה
- צנטריפוגה הדגימה במשך 10 דקות ב 1,500 x גרם ב 4 ° C כדי להסיר תאים ופסולת.
- לאסוף supernatant ולבדוק מיד או aliquot לתוך צינורות microcentrifuge פוליפרופילן ולאחסן ב ≤ -20 °C.
- הפשרת דגימות ביולוגיות קפואות
- יש להפשיר לחלוטין דגימות ביולוגיות שהוקפאו בעבר על קרח ומערבולות זמן קצר לפני השימוש. הימנע מיותר משני מחזורי הקפאה/הפשרה.
הערה: הדגימות המשמשות בפרוטוקול זה התקבלו על ידי תרבית טחול עכבר BALB/c (1 x 106 תאים ב 37 ° C + 5% CO2 בתנאים שונים: לא מגורה, LPS (100 ng / mL), αCD3 (1 מיקרוגרם / מ"ל מצופה לוחית) + αCD28 (1 מיקרוגרם / מ"ל מסיס), PMA (20 ng / mL) + Ionomycin (500 ng / mL). סופרנאטנטים של תרבית נאספו לאחר 48 שעות ועובדו כמתואר בסעיף 1.3.
2. הכנת מגיב
- הכנת חרוזים משותקים עם נוגדנים מעורבבים מראש
- יש לסחוט בקבוק חרוזים מעורבב מראש למשך דקה אחת באמבט סוניקטור בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לערבב במשך 30 שניות לפני השימוש. אם אין אמבט סוניקטור זמין, הגדילו את זמן המערבולת לדקה.
- הכנת חיץ כביסה
- הביאו את חיץ הכביסה 20x (20x PBS עם 1% Tween-20) המסופק עם הערכה לטמפרטורת החדר ולמערבולת כדי להכניס את כל המלחים לתמיסה.
- לדלל 25 מ"ל של 20x Wash Buffer עם 475 מ"ל של מים נטולי יונים. אחסנו מנות שאינן בשימוש בין 2°C ל-8°C למשך עד חודש.
- הכנת מטריצה B (לשימוש עם דגימות סרום ופלזמה בלבד)
- הוסף 5.0 מ"ל של מאגר Assay (PBS עם 1% BSA) הכלול בערכה לבקבוק המכיל מטריקס B lyophilized. המתן לפחות 15 דקות להרכבה מחדש מלאה, ולאחר מכן מערבולת לערבב היטב. שאריות מטריקס B ניתן לאחסן ב ≤ -70 ° C עד חודש אחד.
3. הכנה סטנדרטית
הערה: לכל אנליט בלוח זה יש ריכוז סטנדרטי עליון של 10,000 pg/mL.
- הוסף 250 μL של מאגר Assay כדי ליצור מחדש את קוקטייל Mouse Th Cytokine Standard Coctail שעבר ליופיליזציה. מערבבים על ידי ערבול קצר ומניחים לבקבוקון לשבת בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
- מעבירים את הקוקטייל הסטנדרטי לצינור מיקרוצנטריפוגה מפוליפרופילן שכותרתו "C7". זה ישמש כסטנדרט העליון.
- תווית 6 צינורות מיקרוצנטריפוגות פוליפרופילן כמו C6, C5, C4, C3, C2 ו- C1.
- הוסף 75 μL של מאגר Assay לכל אחד מצינורות אלה.
- מעבירים 25 μL של C7 הסטנדרטי העליון לצינור C6 ומערבבים היטב על ידי מערבולת. זה יהיה תקן C6.
- המשך לבצע דילול סדרתי ביחס של 1:4 על ידי שימוש בקצה פיפט חדש עבור כל צינור כדי להוסיף 25 μL של התקן הקודם ל- 75 μL של מאגר Assay בצינור התקן הנמוך ביותר, ולאחר מכן מערבולות לקבלת תקנים C5, C4, C3, C2 ו- C1. השתמש במאגר Assay כתקן 0 pg/mL (C0).
4. דילול לדוגמה
הערה: ניסויי פיילוט ראשוניים המשתמשים בבדיקה זו עם דילולים מרובים עשויים להידרש כדי לקבוע את גורם הדילול המתאים ביותר עבור קבוצה מסוימת של דגימות ביולוגיות. מקדם דילול תקין יפיק חישובי ריכוז למדגם הנמצאים בגבולות העקומה הסטנדרטית. השלבים הבאים נועדו כקווים מנחים וייתכן שיהיה צורך לקבוע אותם אמפירית בהתאם לסוג המדגם.
- לדלל דגימות סרום או פלזמה פי 2 עם מאגר Assay (למשל לדלל 50 μL של דגימה עם 50 μL של מאגר Assay) בצינורות מיקרוצנטריפוגות פוליפרופילן.
הערה: אם נדרש דילול דגימה נוסף, יש לבצע דילול עם מטריצה B במקום חיץ בדיקה כדי להבטיח מדידה מדויקת. הוספת דגימות סרום או פלזמה ללא דילול תגרום לדיוק בדיקה נמוך ועלולה לסתום את צלחת המסנן. מטריקס B מורכב מסרום עכבר מאוגד שהתרוקן ממטרות בדיקה אנדוגניות. הוא משמש כסרום או מדלל דגימת פלזמה כדי למנוע השפעות מטריצה, אשר ידועים להשפיע על הרגישות האנליטית של immunoassays.
- בדיקת דגימות סופרנטנט של תרבית תאים ללא דילול.
הערה: רמות האנליט יכולות להשתנות מאוד ממדגם לדגימה. במידת הצורך, דללו דגימות סופרנאטנט באמצעות הכנה חדשה של מדיום תרבית התאים המתאים להן או מאגר Assay.
5. הליך הבדיקה
הערה: ניתן לבצע את הבדיקה בלוחות מסנן פוליפרופילן, בצינורות מיון תאים המופעלים על ידי מיקרו פלואורסצנטיות (FACS) או במיקרו-צלחות V-bottom. הליך בדיקת לוח הסינון מומלץ בשל עקביות טובה של מדגם לדגימה, עמידות הבדיקה וקלות הטיפול. הליך זה דורש יחידת סינון ואקום לכביסה (מסופקת על ידי משתמש הקצה).
- יש לאפשר לכל הריאגנטים להתחמם לטמפרטורת החדר (20 - 25 מעלות צלזיוס) לפני השימוש.
- הניחו את צלחת המסנן על מכסה צלחת הפוכה בכל עת במהלך שלבי ההתקנה והדגירה של הבדיקה, כך שתחתית הצלחת לא תיגע במשטחים כלשהם, מכיוון שהיא עלולה לגרום לדליפה.
- שמרו על הצלחת זקופה במהלך כל תהליך הבדיקה, כולל שלבי הכביסה, כדי למנוע אובדן חרוזים.
- שמור את הצלחת בחושך או עטוף ברדיד אלומיניום לכל שלבי הדגירה.
- הפעל את כל התקנים והדוגמאות ככפילויות המסודרות על הצלחת בסדר רציף.
- הרטיבו מראש את צלחת המסנן על ידי הוספת 100 μL של 1x Wash Buffer לכל באר ותנו לה לשבת למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר (אם אתם משתמשים במיקרו-צלחת עם תחתית המסנן).
- הסר את נפח המאגר באמצעות סעפת הוואקום (5 - 10 שניות). אין לחרוג מ-10 " כספית של ואקום. כתם עודפי חיץ כביסה מתחתית הצלחת על ידי לחיצה על הצלחת על ערימה של מגבות נייר נקיות. הניחו את הצלחת על גבי מכסה הצלחת ההפוכה.
הערה: שלבים 5.1 - 5.2 עשויים להיות מושמטים אם הבדיקה מבוצעת באמצעות מיקרו-צלחת V תחתונה או צינורות micro FACS.
- עבור דגימות supernatant תרבית תאים, להוסיף 25 μL של חיץ Assay לכל הבארות. הוסף 25 μL מכל תקן לבארות הסטנדרטיות. הוסף 25 μL מכל דגימה לבארות הדגימה.
- למדידת דגימות סרום או פלזמה, הוסף 25 μL של מטריקס B לבארות הסטנדרטיות. הוסף 25 μL של מאגר Assay לבארות הדגימה. הוסף 25 μL מכל תקן לבארות הסטנדרטיות. הוסף 25 μL של כל סרום מדולל או דגימת פלזמה לבארות הדגימה.
- מערבולת חרוזים מעורבים במשך 30 שניות. מוסיפים 25 μL של חרוזים מעורבים לכל באר, מנערים את בקבוק החרוזים לסירוגין כדי למנוע שקיעת חרוזים. הנפח הסופי צריך להיות 75 μL בכל באר לאחר תוספת של חרוזים.
- אוטמים את הצלחת עם אוטם צלחת. עטפו את הצלחת כולה, כולל מכסה הצלחת ההפוכה, ברדיד אלומיניום. הניחו את הצלחת על שייקר צלחת, הדקו אותה ונערו במהירות של כ-500 סל"ד במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. למניעת דליפה, אין להפעיל לחץ חיובי על אוטם הצלחת
.
- ללא היפוך, הניחו את הצלחת על סעפת הוואקום, מרחו ואקום כמו קודם והוסיפו 200 מיקרוליטר של חיץ כביסה 1x לכל באר.
- הסר את התוכן של בארות צלחת הבדיקה על ידי סינון ואקום. כתם חיץ שטיפה עודף מתחתית הצלחת עם פד סופג או מגבות נייר. חזור על שלב זה פעם נוספת.
הערה: אם הבדיקה מבוצעת באמצעות מיקרו-צלחת תחתית V או צינורות micro FACS, דלג על שלבים 1.12 ו- 1.13. במקום זאת, צנטריפוגו את הצלחת במהירות של 1,000 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הסירו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה רב ערוצית.
- יש להוסיף 25 μL של נוגדנים לגילוי (ראה טבלת חומרים) לכל באר.
- אוטמים את הצלחת עם אוטם צלחות טרי. עטפו את הצלחת כולה, כולל מכסה הצלחת ההפוכה, ברדיד אלומיניום.
- מניחים את הצלחת על שייקר צלחת ומנערים במהירות של כ-500 סל"ד למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- ללא שאיבת אבק, יש להוסיף 25 μL של מגיב סטרפטווידין-פיקואריתרין (SA-PE) ישירות לכל באר. אין צורך בדילול של המגיב
.
- אוטמים את הצלחת עם אוטם צלחות טרי. עטפו את הצלחת כולה, כולל מכסה הצלחת ההפוכה, ברדיד אלומיניום.
- מניחים את הצלחת על שייקר ומנערים במהירות של כ-500 סל"ד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- חזור על שלב 1.13 לעיל.
- יש להוסיף 200 μL של 1x Wash Buffer לכל באר. השהו מחדש את החרוזים על שייקר צלחות למשך דקה.
- באמצעות צינור רב-ערוצי, העבר דגימות מלוח המסנן לצינורות FACS כדי לקרוא דגימות בציטומטר זרימה.
הערה: ניתן להגדיל את נפח הדגימה מ-200 μL ל-300 μL על ידי הוספת 100 μL נוספים של 1x Wash Buffer לכל צינור כדי למנוע מהדגימה להתייבש. במידת הצורך, ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של 4°C, להגן עליהן מפני אור ולנתח אותן למחרת. עם זאת, אחסון ממושך של דגימות עלול להוביל לאות מופחת.