ניתוח מבוסס ציטומטריה של זרימה של הפעלת תאים דנדריטיים באמצעות קומפלקסים חיסוניים

Abstract

מקור: Santana-Magal, N., et al. פרוטוקול בידוד של תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים בעכבר והפעלתם לאחר מכן במבחנה עם קומפלקסים חיסוניים של הגידול.J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים פרוטוקול להערכת ההפעלה של תאים דנדריטיים באמצעות תאי גידול מצופים אימונוגלובולין G (IgG). תאים דנדריטיים מפנימים את תאי הגידול המצופים IgG, מעבדים את האנטיגנים של הגידול ומציגים אותם על פני השטח באמצעות מולקולות MHC-II, יחד עם ביטוי משותף של מולקולת קוסטימולטורית CD86. תאים דנדריטיים אלה עוברים ניתוח של אימונוסטיין ממוקד MHC-II ו-CD86 וניתוח ציטומטריית זרימה כדי לזהות את מצב ההפעלה שלהם.

Protocol

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. בידוד תאים דנדריטיים הקשורים לגידול

1. במכסה מנוע של זרימה למינרית, יש להסיר גידולים מעכברים שעברו המתת חסד CO₂ ולמקם גידולים במדיום RPMI ללא נסיוב בקר עוברי (FBS).
   הערה: מומלץ מאוד לגלח את העכברים ולרסס אותם באתנול 70% לפני הסרת הגידולים כדי למזער זיהומים פוטנציאליים מהפרווה. ודא כי הגידול אינו עולה על 25 - 40 מ"מ² מאז גידולים גדולים יש פחות תאים דנדריטיים (DC) נוטים להיות שבירים נוטים לעבור מוות תאי. אם יש צורך במספר גדול יותר של DC, ניתן להזריק לכל עכבר תאי גידול במספר אתרים.
2. מתחת למכסה מנוע למינרי סטרילי, קוצצים את הגידולים לחתיכות קטנות (בערך 1 x 1 מ"מ²) באמצעות מספריים לניתוח.
   1. הוסף את כל שברי הגידול מעכבר אחד לתוך צינור סטרילי בעל תחתית שטוחה של 30 מ"ל עם מוטות ערבוב מגנטיים המכילים 5 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS), 2 מ"ג / מ"ל collagenase IV ו- 0.01 מ"ג / מ"ל DNase I.
      זהירות: תאים מיאלואידים מייצרים אנרגיה באמצעות גליקוזילציה, אפילו במצב יציב. לכן, השתמשו רק במדיה המכילה גלוקוז (למשל, HBSS, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ו-Modified Eagle Medium (DMEM) של Dulbecco), שכן רעב גלוקוז למשך 10-15 דקות בלבד יגרום למוות תאי ולאפופטוזיס תוך 24 שעות. השתמש רק נמוך אנדוטוקסין collagenase IV, כמו collagenase מיוצר על ידי חיידקים חיוביים (Clostridium histolyticum).
3. מערבבים בערך 200 - 400 סל"ד באינקובטור של 37 ^מעלותצלזיוס עם מערבל מגנטי למשך 20-30 דקות.
4. הוסף 5 מ"ל של מדיה מלאה והשהה מחדש במרץ.
5. סנן תאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר. צנטריפוגה ב 4 ^oC 400 rcf במשך 5 - 10 דקות כדי pellet את התאים.
   זהירות: אין לנסות לבודד את התאים ישירות לאחר העיכול האנזימטי, מכיוון שגידולים מסוימים הם נמקיים ומכילים כמויות גדולות יחסית של פסולת תאים או מטריצה חוץ-תאית. החל תאים על מדיום הדרגתי של צפיפות של 15% כדי לקבל רק את התאים.
6. השהה 9 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות עם 1 מ"ל של 10x מלוחים חוצצי פוספט (PBS) כדי להתאים אוסמולליות ולקבל 100% תמיסת מלאי פרקול. ערבבו תמיסת מלאי בינוני בצפיפות 1.5 מ"ל עם HBSS בצפיפות 1.5 מ"ל וערבבו אותה במרץ עם כדורית תאים שמקורה בגידול. שכבה עדינה 2 מ"ל של DMEM בחלק העליון של מדיום שיפוע בצפיפות של 15% וצנטריפוגה ב 400 rcf למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנאטנטים, מכיוון שהתאים ייצרו גלולה בתחתית הצינור.
   1. שטפו את התאים הכדוריים פעמיים על ידי השעייתם מחדש ב-HBSS של 10 מ"ל המכיל 2% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו-10 mM חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA) (מאגר בידוד), וצנטריפוגה ב-4 ^oC 400 rcf למשך 5-10 דקות כדי לגרוף את התאים.
   2. ספרו תאים על המוציטומטר באמצעות טריפאן כחול תחת מיקרוסקופ אור.
7. להשהות מחדש 1 x 10⁸ תאים במאגר בידוד 1 מ"ל ולדגור אותם ב 4 ^oC עם 30 μL של CD11b ⁺ חרוזים מגנטיים מצומדים במשך 15 דקות.
   זהירות: הימנע משימוש בחרוזים מצומדים CD11c, מכיוון שזה יפעיל את DC ויגרום למוות תאי. אל תנסה לחסום את FcγRII ו- FcγRIII עם נוגדנים נגד CD16/32. נוגדנים חוסמים את ה-FcγR, גורמים לזרחון חזק של קינאזות חלבונים המופעלים על ידי מיטוגן (MAP), ומפריימים את ה-DC.
   1. הסר את החרוזים הלא קשורים העודפים על ידי הוספת 9 מ"ל של תאי חיץ בידוד וצנטריפוגות ב 400 rcf למשך 5 - 10 דקות ב 4^oC.
8. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש תאים במאגר בידוד של 1 מ"ל. החל את התאים על עמוד מגנטי שטוף מראש. שטפו את העמוד פעמיים עם 3 מ"ל של מאגר בידוד.
   1. הסירו את העמוד מהמגנט. פיפטה 6 מ"ל של חיץ בידוד על העמוד ולשטוף את התאים המסומנים מגנטית לתוך צינור איסוף סטרילי על ידי דחיפת הבוכנה. תאי צנטריפוגה ב 400 rcf במשך 5 - 10 דקות ב 4 ^oC.
   2. להשהות מחדש תאים ב 100 μL לכל 1 x 10⁷ תאים ולהכתים עם נוגדנים מצומדים פלואורופור הבאים: Linage שלילי (TCRb, Siglec F, B220, CD19, FceRI ו Ly6G), MHCII, Ly-6C.
9. מיין תאים על-ידי חיתוך התאים הקטנים, באמצעות פיזור צדדי (SSC) ופיזור קדמי (FSC), ותרבית בתווך שלם בתוספת 5 ננוגרם/מ"ל GM-CSF - דגירה על תאים למשך שעה אחת ב-37 ^מעלותצלזיוס כדי לאפשר למקרופאגים להיצמד לצלחת. לאחר מכן, העבירו את התאים הרופפים והלא דבקים לצלחת תרבית חדשה.
   הערה: MoDC עכבר מוגדרים כ- CD11b⁺/CD11c⁺/MHCII^hi/Ly6C^lo/int. הביטוי של Ly6C עשוי להשתנות באופן דרמטי בין מודלים של גידולים, ובמודלים מסוימים (למשל, LMP), MoDCs חסרים לחלוטין ביטוי Ly6C. גידול אחד של 100 מ"מ³ B16F10 מכיל בדרך כלל 5 x 10⁴ של DC, וכתוצאה מכך בערך 4 - 5 x 10⁶ תאים בסך הכל. מתוך תאים אלה, 10-15% הם תאי חיסון ו-8%-10% הם MoDC. הגדלת מספרי DC יכולה להיות מושגת על ידי הזרקת עכברים עם גידולים במספר אתרים. מיין רק תאי SSC/FCS קטנים, מכיוון שתאים מיאלואידים אחרים יכולים לבטא סמנים כגון CD11c ו- Ly6C.
   אופציונלי: מיין את המונוציט החודר לגידול כתאי SSC/FSC קטנים המבטאים Ly6C^hi ושליליים ל- MHCII. לאחר מכן, תרבית מונוציטים במבחנה עם 50 ng / mL GM-CSF כדי לקבל DC.

2. הכנת קומפלקסים חיסוניים גידול-IgG

1. תרבית תאי גידול בבקבוק תרבית^{של 75} ס"מ 2 עד 70% מפגש במדיית DMEM מלאה.
   1. הוסף 2 מ"ל של 0.25% טריפסין/EDTA כדי לנתק תאים מבקבוק התרבית ולנטר את המורפולוגיה של התא תחת מיקרוסקופ אור כדי למנוע טריפסיניזציה יתר.
   2. הוסף 8 מ"ל של מדיה תרבית מלאה (לכל 2 מ"ל של טריפסין) כדי לעכב עיכול טריפסין, וצנטריפוגה ב 4 ^oC, 400 rcf במשך 5-10 דקות כדי pellet את התאים.
      הערה: בדוק תאי הגידול עבור Mycoplasma באמצעות ערכת PCR מסחרית. בדיקת חיידקים גראם-שליליים ואנדוטוקסינים פטרייתיים באמצעות בדיקת לימולוס אמבוציטים ליזט (LAL). הסרום חייב להיות מסונן דרך 0.22 מיקרומטר ונבדק עבור 9 קוד של תקנות פדרליות וירוסים. בנוסף, בדוק את תרבית מדיה וסרומים על ידי הטלת 100 - 200 μL על אגר LB או מרק ותרבית במשך 2 ימים ב 37 ^oC.
   3. יש לשטוף שוב תאים משאריות טריפסין וסרום על ידי השעייתם מחדש ב-PBS של 10 מ"ל וצנטריפוגה ב-400 rcf למשך 5-10 דקות. יש לשאוף סופרנאטנט ולחזור על השטיפה פעמיים נוספות.
2. תקן תאים בפאראפורמלדהיד חוצץ של 1.8% למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
   1. לשטוף את התאים על ידי השעייתם מחדש ב 10 מ"ל PBS וצנטריפוגה ב 4 ^oC 400 rcf במשך 5 - 10 דקות.
   2. שאפו סופרנאטנטים וחזרו על הכביסה פעמיים נוספות.
      אופציונלי: עבור בדיקות ספיגת גידולים, תאים יכולים להיות מסומנים על ידי דגירה שלהם במשך 5 דקות ב 37 ^oC ב PBS המכיל 1 מיקרומטר carboxyfluorescein succinimidyl אסטר (CFSE). לאחר מכן CFSE מרוה עם מדיה מלאה במשך 10 דקות בקרח. יש לשטוף את התאים באופן נרחב ב-PBS המכיל 2% סרום כדי להסיר שאריות צבע.
3. השהה מחדש תאים במאגר מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) (PBS בתוספת 2% FCS + 5 mM EDTA) ו- 0.5 מיקרוגרם / מ"ל של אנטי CD16/32 כדי לחסום אינטראקציות פוטנציאליות לא ספציפיות של חלבון-חלבון. צלחת בצורת U 96 בארות / צלחת בריכוז של 1 x 10⁵ תאים לכל 100 μL.
   1. הוסף דילולים שונים של נוגדנים קושרי גידול החל מ 5 מיקרוגרם - 5 ng / 1 x 10⁵ תאים. לדגור את הצלחת על קרח במשך 15-20 דקות.
      הערה: נוגדני IgG בודדו מהסרום של עכברות נאיביות בנות 20-24 שבועות על עמודות חלבון A, כמתואר.
4. לשטוף תאים על ידי הוספת 150 μL של PBS וצנטריפוגה את הצלחת ב 4 ^oC 400 rcf במשך 5 - 10 דקות.
   1. השליכו את הסופרנאטנטים וחזרו על השטיפה פעמיים. תאי השהיה מחדש במאגר FACS של 100 μL המכיל נוגדן משני מצומד פלואורופור. דוגרים צלחת על קרח במשך 20 דקות.
   2. יש לשטוף תאים על ידי הוספת 200 μL של חיץ FACS וצנטריפוגה של הצלחת בעוצמה של 400 rcf למשך 5 - 10 דקות. יש להשליך את הסופרנאטנטים ולחזור על השטיפה.
   3. לנתח את קשירת הגידול על ידי ציטומטריית זרימה ולקבוע את הריכוז המינימלי הדרוש כדי לצפות את התאים.
      הערה: אין להשתמש בנוגדנים שאינם מגבירים את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת (MFI) של תאי גידול מוכתמים לפחות פי חמישה מעל בקרת איזוטיפ בבדיקות תפקודיות עוקבות.

3. הפעלת MoDC עם מעגל-משולב מסוג Tumor-IgG

1. ציפוי תאי גידול עם ריכוז IgG מינימלי, כמתואר בסעיפים 2.1 עד 2.4.3
   1. יום אחד לפני הפעלת MoDC עם IC גידולי, להחליף את מדיית התרבית של MoDC המכילה GM-CSF. לשם כך, שאפו בעדינות את המדיה ושטפו את התאים פעם אחת בתרבית שלמה שחוממה מראש.
      הערה: MoDC בוגר מבודד הקשור לגידול צריך להיות בתרבית לפחות 2 - 3 שעות (או אפילו לילה) לאחר מיון במדיה מלאה ללא GM-CSF, ולפני הפעלתם עם IC.
   2. לניתוחי ספיגת גידולים, הוסף את IC הגידול המסומן ב- CFSE ל- MoDC ביחס של 1:5 (IC: MoDC) ודגור במשך הלילה במשך 12 - 16 שעות ב- 1 מ"ל של מדיה מלאה לכל 1 x 10⁶ DC.
   3. לניתוח FACS של ניסויי הפעלה של MoDC, יש להוסיף גידול-IC ביחס של 1:1 (IC:MoDC) ולדגור במשך הלילה במשך 12 - 16 שעות
      הערה: מומלץ מאוד לכלול באר בקרה חיובית, שבה MoDC מגורה עם 1 מיקרוגרם/מ"ל של LPS או אגוניסטים אחרים של TLR.
   4. לאחר ההפעלה בלילה, יש לשאוף את הסופרנאטנטים ולשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם מאגר בידוד או 10 mM EDTA HBSS.
   5. כדי לנתק DC מהצלחת, יש לדגור על תאים למשך 2 - 3 דקות ב- 1 מ"ל HBSS המכיל 10 mM EDTA ולנתק תאים על ידי פיפטינג נמרץ.
   6. תאי צנטריפוגות ב 400 rcf ו re-suspend 1 x 10⁶ DC ב 90 μL PBS בתוספת 2% FCS, 5 mM EDTA (FACS buffer) ו 0.5 מיקרוגרם של נוגדנים חוסמים. דוגרים על קרח במשך 5 - 10 דקות.
   7. מוסיפים 10 μL של תערובת נוגדנים מכתימים לתאים ודגורים על קרח למשך 15 דקות.
   8. הוסף חיץ FACS של 2 מ"ל לתאים וצנטריפוגה ב- 4 ^oC 400 rcf למשך 5 - 10 דקות.
2. השהה מחדש תאים במאגר FACS של 200 μL.
   1. הוסף 0.5 - 1 מיקרוגרם/מ"ל של DAPI 1 - 2 דקות לפני הפעלת הדגימות כדי לא לכלול תאים מתים בניתוחים. אין לדגור יתר על המידה על DAPI, מכיוון שמשרד ההגנה ייקח אותו תוך 10 - 15 דקות.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque פרימיום	GE-Healthcare	17-5442-02
OptiPrep	טכנולוגיות StemCell	7820
CD45 MicroBeads	מילטני	130-052-301
ערכת בידוד מונוציטים EasySep	טכנולוגיות StemCell	19861
קולגנאז IV	סיגמא	C9697-50MG	בדוק כל מנה עבור אנדוטוקסין
DNase I	סיגמא	DN25-10MG
HBSS	תרמופישר	14025092
פ.ב.ס.	תרמופישר	16140071	בדוק כל מנה עבור אנדוטוקסין
PE-CD11c	ביואגדה	117307
APC-CD11b	ביואגדה	101211
סגול מבריק 650 MHCII	ביואגדה	107641
AF48- CD86	ביואגדה	105017
APC/Cy7-LY-C6	ביואגדה	108423
PE/Cy7-CD15	ביואגדה	135523