1. הכנת האימונוגנים
- לגדל כל זן ציאנובקטריאל בתווך התרבית המתאים בתנאים המתוארים בטבלה 1.
הערה: תנאי מדיום הגידול והתרבית עבור כל זן ציאנובקטריה מפורטים בטבלה 1. כל הזנים הציאנובקטריאליים, למעט K17, שייכים לקבוצתו של אנטוניו קסאדה מאוניברסיטת אוטונומיה (מדריד, ספרד). הנוגדן נגד Planktothrix rubescens נוצר מדגימה טבעית של הפריחה החד-ספציפית של ציאנובקטריום זה ממאגר וילאסוטו (צפון ספרד).
- כמת את מספר התאים באמצעות תא ספירת תאים באמצעות מיקרוסקופ אופטי כדי לקבל כ -108 תאים / מ"ל מתרבית שלב צמיחה מעריכית או נייחת מאוחרת.
- קצור תאים מ 5 מ"ל של תרבית על ידי צנטריפוגה ב 2,000 x גרם במשך 5 דקות.
- השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים בצינור של 10 מ"ל עם 5 מ"ל של 1x מלוחים חוצצי פוספט (1x PBS) כדי לקבל כ-108 תאים/מ"ל.
- הומוגניזציה וליזה של תאי המתלה על ידי סוניקציה במשך 5 מחזורים, 30 שניות כל אחד, עם הפסקה של 30 עד 60 שניות על קרח, באמצעות מעבד קולי נייד ידני או על ידי טבילת הצינור באמבט המים של משבש תאים באמפליטודה מקסימלית (30 קילוהרץ).
- חזור על שלבים 1.3 - 1.5 עבור כל זן של ציאנובקטריום.
הערה: סוניקציה מייצרת הפרעה בתאים ושחרור תוכן סלולרי. בעוד חלבונים ורב-סוכרים הם אימונוגנים טובים, מולקולות ספציפיות, כגון שומנים וחומצות גרעין, אינן מעוררות תגובה אימונוגנית הומורלית בפני עצמן. לכן, הם חייבים להיקשר נשאים, כגון סוכרים או חלבונים, כדי להגדיל את המורכבות המולקולרית. בנוסף, סוניקציה משחררת חומר תוך תאי שיכול לעורר ייצור נוגדנים.
2. ייצור נוגדנים רב-שבטיים
- הכן את מינון האימונוגן הראשון על ידי ערבוב 0.5 מ"ל של ליזט התא קולי המתקבל בשלב 1.5 עם 0.5 מ"ל של האדג'ובנט של פרוינד מלא. לספק אותו למפעיל של מתקן בעלי חיים לייצור נוגדנים ארנב רב שבטי.
- הכינו שלוש מנות נוספות כבעבר לשימוש נוסף כמגביר את הזיכרון בתהליך ייצור הנוגדנים על ידי ערבוב 0.5 מ"ל של אותו הומוגנט / ליזט המתקבל בשלב 1.5 עם 0.5 מ"ל של האדג'ובנט של פרוינד לא שלם. תן אותם למתקן בעלי חיים כדי למלא את תהליך ייצור הנוגדנים.
- חזור על שלבים 2.1 ו- 2.2 עבור כל תהליך ייצור נוגדנים חדש.
הערה: בדרך כלל, ייצור נוגדנים מופקד בידי מתקנים מיוחדים לבעלי חיים או חברות מכיוון שנדרשים רישוי והכשרה מתאימים לעבודה עם בעלי חיים. החברות מספקות בדיקת אימונוסורבנט יחסית מקושרת אנזים (ELISA) של כמות הנוגדנים הספציפיים לאנטיגן הנמצאים בדגימת הסרום.
3. טיהור נוגדנים
- לטהר את מקטע האימונוגלובולין G (IgG) הן מהסרום החיסוני והן מהסרום הקדם-חיסוני שנאסף בשלב 2 על ידי כרומטוגרפיית זיקה של חלבון-A. כמה ערכות טיהור מסחריות, המבוססות על מערכות מחסניות, עובדות היטב; בצע את ההוראות לספק.
- כאשר ערכת הטיהור אינה מספקת מערכת התפלה, יש לשנות את החיץ לאחר הוצאת הנוגדנים המטוהרים ל-PBS 0.1x, בין אם על ידי דיאליזה או באמצעות מכשירי סינון צנטריפוגליים בעלי גודל נקבוביות קרום של 100-kDa (או נמוך יותר).
- קבע את ריכוז הנוגדנים על ידי מדידת הספיגה ב 280 ננומטר או באמצעות שיטות קולורימטריות, כגון Bradford, Lowry, או חומצה Bicinchoninic (BCA).
הערה: חשוב להימנע מהכללת קבוצות אמין במאגר האלוטיון (למשל, מאגרי טריס) מכיוון שהם מתחרים עם הנוגדן על קשירה למשטחים מוצקים המופעלים עם קבוצות אפוקסי. לאחר הטיהור, חשוב לבדוק את פעילות הנוגדנים עם ELISA.
4. תיוג נוגדנים פלואורסצנטיים
- יש לתייג את הנוגדנים המטוהרים המתקבלים בסעיף 3 עם פלואורוכרום (למשל, צבע פלואורסצנטי אדום רחוק) על ידי המסת בקבוקון מסחרי המכיל צבע לצורך סימון 1 מ"ג חלבון ל-100 מיקרוליטר של דימתיל סולפוקסיד (DMSO). יש להוסיף 2 μL של הצבע המומס לכל תכשיר נוגדנים בריכוז של 2 מ"ג/מ"ל בנפח סופי של 50 μL במי מלח חוצצי פוספט 50 מ"מ (pH 8.5).
- שמרו על תגובות התיוג תחת תסיסה מתמשכת למשך שעה אחת בטמפרטורת הסביבה ו-1,200 סל"ד על פלטפורמה רוטטת.
- לטהר את הנוגדנים המסומנים לפי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (למשל, באמצעות ג'ל עם טווח שברים בין 1.5 ל -30 kDa לכודים בעמודה), בהתאם להמלצות הספק.
- מדוד את הספיגה ב- 280 ננומטר וב- 650 ננומטר ב- eluates וחשב את יעילות ההתוויה בהתאם להמלצות הספקים.
הערה: ניתן לבצע עד 50 x 50-μL תגובות לסימון נוגדנים עם בקבוקון יחיד של צבע פלואורסצנטי לתיוג 1 מ"ג חלבון. מומלץ לכסות את הצינורות ברדיד אלומיניום או לחילופין להשתמש בצינורות אטומים של 0.5 מ"ל כדי למנוע תהליכי מרווה לאחר שלב 4.3. עבור נוגדני IgG, תיוג אופטימלי מושג עם 3-7 mol של צבע לכל mol של נוגדן.
5. ייצור CYANOCHIP
- נוגדנים ובקרות בתמיסת הדפסה
- הכן 30 μL מכל נוגדן מטוהר בתמיסת הדפסה על ידי ערבוב כל נוגדן במינון 1 מ"ג/מ"ל במאגר הדפסת חלבון מסחרי 1x עם 0.01% (v/v) Tween 20 (חומר ניקוי לא יוני), והכל בריכוזים סופיים.
הערה: לחלופין, תמיסת נוגדנים עשויה להכיל 20% גליצרול, 1% (w/v) סוכרוז (או טרהלוז, כחומר משמר), ו-0.01% (v/v) טווין 20 בחיץ פחמתי (pH 8.5).
- הכן 30 μL של תמיסת ההדפסה כאמצעי בקרה: (א) מאגר הדפסת חלבון אחד עם 0.01% (v/v) Tween 20, (b) חלבון-סרום קדם-חיסוני מטוהר במינון 1 מ"ג/מ"ל במאגר הדפסת חלבון אחד עם 0.01% (v/v) Tween 20, ו-(c) אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-1 מ"ג/מ"ל במאגר הדפסת חלבון אחד עם 0.01% (v/v) Tween 20.
- הכינו 30 μL של סרום קדם-חיסוני מטוהר עם תווית פלואורסצנטית בריכוזים שונים (למשל, מ-50 מיקרוגרם/מ"ל עד 1 מק"ג/מ"ל) במאגר הדפסת חלבון אחד עם Tween 20, כמו בשלב 5.1.1. דגימות אלה ישמשו כסמני מסגרת פלואורסצנטיים ולכימות פלואורסצנטי יחסי לאחר האיתור.
- הוסף 30 μL לכל באר של פתרונות ההדפסה שהוכנו בשלבים 5.1.1, 5.1.2 ו- 5.1.3 למיקרו-צלחות באיכות הגבוהה ביותר של 384 בארות לייצור microarray כגון פוליפרופילן.
הערה: מאגר הדפסת חלבונים מגביר את האיכות והיציבות של הנוגדנים, ו- Tween 20 הומוגני מורפולוגיה נקודתית ובונה צימוד חלבונים. מומלץ לשמור על microplate 384-well ב 4 ° C לפני השימוש. אחסנו אותו בטמפרטורה של -20°C לפרקי זמן ארוכים. לפוליפרופילן יש DNA נמוך, חלבון, תמצית תאים, וקישור פנימי של מולקולות קטנות.
- הדפסת נוגדנים על גבי שקופית מיקרוסקופ
הערה: הדפס את הנוגדנים על שקופיות מיקרוסקופ מופעל באמצעות פלטפורמות מערך שונות, כגון מגע, מחט מפוצלת או התקנים ללא מגע, כגון מדפסות פיאזואלקטריות או טכנולוגיות "הזרקת דיו". בעבודה זו, CYANOCHIP הודפס באופן שגרתי על ידי מגע באמצעות מערכת רובוטית (מערך) המסוגלת לזהות כמויות nL של נוגדנים בקנה מידה מיקרומטר.
- הגדר את התנאים הסביבתיים של חדר ההדפסה ל -20 ° C ו 40 - 50% לחות יחסית.
- הגדר את מצעי השקופיות (לדוגמה, שקופיות זכוכית במיקרוסקופ אפוקסי בגודל 75 x 25 מ"מ) כדי לבצע מספר מערכי נוגדנים זהים בכל שקופית.
- זהה כל נוגדן מטוהר, כולל פקדים ומסגרת הייחוס, בתבנית ספוט משולש; בתנאים אלה, הכתמים הם בקוטר 180 - 200 מיקרומטר.
- לאחר ההדפסה, השאר את השקופיות למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורת הסביבה כדי לאפשר להן להתייבש, ולאחר מכן אחסן אותן ב- 4 °C; לעבודה בשטח, ניתן להעביר ולאחסן את השקופיות בטמפרטורת הסביבה למשך מספר חודשים.
הערה: ה- CYANOCHIP מודפס בתבנית microarray ספוט משולש עם 3 x 8 microarrays זהים לכל שקופית או 9 מערכים זהים בתבנית microarray 1 x 9. כל גודל מערך לא יכול להיות גבוה ממידות תא התגובה עבור אטם 24 בארות (בדרך כלל 7.5 x 6.5 מ"מ בתא הכלאה 3 x 8).
- לפני השימוש במיקרו-מערך לניתוח דגימות סביבתיות, השתמש ב-Fluorescent sandwich microarray immunoassay (FSMI) כדי לקבוע את דילול העבודה עבור כל נוגדן בעקומת טיטרציה. עבור כל נוגדן, השתמש בריכוז סטנדרטי של האימונוגן המתאים (103 - 104 תאים / מ"ל) ודילול סדרתי של הנוגדן הפלואורסצנטי (בין 1:500 ל -1:32,000). ריכוז הנוגדנים האופטימלי מתאים ל -50% מעוצמת האות המקסימלית המתקבלת בעקומת הטיטרציה. כמו כן, יש לקבוע את הרגישות והספציפיות עבור כל נוגדן, כמתואר ב- Blanco et al.
6. הכנת תמציות מולטיאנליטים סביבתיים עבור הסנדוויץ' הפלואורסצנטי Microarray Immunoassay (FSMI)
- תמצית מולטיאנליט מדגימה נוזלית
- קח 1 - 100 מ"ל של הדגימה הנוזלית עם מזרק סטרילי (למשל, מים מחוף של מאגר מים); כמות הדגימה תלויה מאוד בריכוז הפוטנציאלי של המטרות.
- רכז את התאים על ידי העברת דגימת המים דרך גודל נקבוביות של 3 מיקרומטר, מסנן פוליקרבונט בקוטר 47 מ"מ; ריכוז תאי בין 103 - 108 תאים / מ"ל רצוי לזיהוי חיובי, אך הריכוז בפועל אינו ידוע.
- לשחזר את הביומסה שנאספה במסנן עם 1 מ"ל של מלח Tris-buffered שונה, Tween 20-חיזוק חיץ (TBSTRR; 0.4 M Tris-HCl (pH 8), 0.3 M NaCl, ו 0.1% Tween 20) על ידי גירוד אותו עם מרית לתוך צינור 15 מ"ל.
- הומוגניזציה ופירוק באמצעות מעבד קולי ידני, כמתואר בשלב 1.5, או פשוט על ידי פיפטציה למעלה ולמטה מספר פעמים; זה מכין את הדגימה לניתוח על ידי microarray.
- תמצית מולטיאנליט מדגימה מוצקה
- שקלו עד 0.5 גרם מהדגימה המוצקה (למשל, סלע, אדמה או משקעים) לתוך צינור של 10 מ"ל והוסיפו עד 2 מ"ל TBSTRR.
- סוניק על ידי טבילת הגשושית הסוניקטור בצינור, על ידי טבילת הצינור באמבט המים של קרן סוניקטור חזקה, או על ידי שימוש בסוניקטור ידני. בצע לפחות 5 מחזורים של 30 שניות ב- 30 קילוהרץ, ועצור למשך 30 שניות כשאתה על קרח.
- סנן להסרת חול, חימר וחומר גס אחר באמצעות מזרק בנפח 10 מ"ל המחובר למחזיק מסנן ניילון בקוטר 10 עד 12 מ"מ, בגודל 5 עד 20 מיקרומטר לנקבוביות. דחפו את הדגימה דרך המסנן לתוך צינור של 1.5 מ"ל. אם המסנן רווי, להתסיס את ההשעיה במזרק ולקחת אותו אחד חדש; זה מכין את חומר הסינון עבור immunoassay (שלב 7).
הערה: קיבולת האגירה של TBSTRR תלויה בסוג הדגימה. חשוב לבצע את immunoassay מיד לאחר הכנת תמצית סביבתית כדי למנוע את ההשפעה של השפלה אנזימטית על analytes. לחלופין, הוסיפו מעכבי פרוטאז לתמצית הסביבתית והקפיאו בטמפרטורה של -80°C עד לשלב הבא.
7. כריך פלואורסצנטי Microarray Immunoassay (FSMI)
- חסימת CYANOCHIP
הערה: מיד לפני השימוש, יש לטפל בשקופיות המודפסות כדי לחסום את כל קבוצות האפוקסי החופשיות בשקופית ולהסיר את עודף הנוגדנים שאינם קשורים באופן קוולנטי.
- יש לטבול את המיקרו-מערך לתוך תמיסת Tris-HCl (pH 9) בנפח 0.5 מ' עם תמיסת BSA של 5% (w/v) על משטח נקי (למשל, צלחת פטרי או צינור של 50 מ"ל) עם תסיסה קלה מפלטפורמת נדנדה למשך 5 דקות. לחלופין, הניחו את המגלשה על טיפה של 100 עד 200 מיקרוליטר של התמיסה הנ"ל כשנקודות המיקרו-מערך פונות אליה. עזוב במשך 3 - 5 דקות ולאחר מכן להמשיך.
- הרימו בזהירות את המגלשה באמצעות מלקחיים עם קצוות פלסטיק; נסו להימנע מלגעת באזורי מיקרו-מערך. סלק את עודף הנוזלים על ידי דפיקה רכה של המגלשה על מגבת נייר. טבול אותו בתמיסת 0.5 M Tris-HCl (pH 8) עם 2% (w/v) BSA למשך 30 דקות עם תסיסה קלה מפלטפורמת נדנדה.
- יבש את המגלשה על ידי ביצוע צנטריפוגה קצרה (200 - 300 x גרם למשך דקה) באמצעות מיקרוצנטריפוגה מסחרית המותאמת לשקופיות מיקרוסקופ. לחלופין, יבשו את המגלשה על ידי דפיקה רכה על מגבת נייר.
- דגירה של תמצית דגימה multianalyte עם microarray
- הגדר את השקופית בקסטת הכלאה מסחרית של microarray עם 24 בארות עבור מיקרו-מערכים מרובים; בצע את הוראות הספק.
- לאחר החלקה והרכבת קלטת, פיפטה עד 50 μL של תמצית הדגימה או דילול שלה TBSTRR לתוך כל באר של הקלטת.
- חזור על שלב 7.2.2 עבור כל דגימה שיש לנתח.
- כבקרה ריקה, פיפטה 50 μL של TBSTRR חוצצת לתוך לפחות שתי בארות נפרדות של הקלטת.
- יש לדגור בטמפרטורת הסביבה למשך שעה אחת עם ערבוב על ידי פיפטינג כל 15 דקות או על ידי השארת המוצר תחת ניעור קל. לחלופין, יש לדגור במשך 12 שעות בטמפרטורה של 4°C.
הערה: השתמש באטמי דגירה אחרים כפונקציה של תבנית המיקרו-מערך. הזמן והטמפרטורה של הדגירה בשלב 7.2.5 הם פרמטרים אמפיריים התלויים בדרך כלל בזיקה ובקינטיקה הקושרת של כל נוגדן-אנטיגן מזווג.
- כביסה
- הסר את הדגימות על ידי הנחת הקלטת ודפיקתה בזהירות על נייר נקי וסופג.
- לשטוף את הבארות על ידי הוספת 150 μL של TBSTRR לכל אחד, ולחסל את החיץ, כאמור לעיל.
- חזור על שלב 7.3.2 שלוש פעמים נוספות.
- דגירה עם נוגדנים לגלאי פלואורסצנטי
- הוסף 50 μL של תערובת נוגדנים המכילה את 17 הנוגדנים נגד זן ציאנובקטריאלי, כל אחד מסומן עם פלואורוכרום ב- TBSTRR עם 1% (w/v) BSA. לקבוע את הריכוז של כל נוגדן פלואורסצנטי בתערובת (מ 0.7 עד 2 מיקרוגרם / מ"ל) על ידי ביצוע ניסויי טיטרציה של כל זוג אנטיגן/נוגדנים.
- יש לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת הסביבה, כמתואר בשלב 7.2.5, או למשך 12 שעות בטמפרטורה של 4°C.
- שטיפת הנוגדנים הפלואורסצנטיים
- הסר את הנוגדנים הפלואורסצנטיים הבלתי קשורים, כמו בשלב 7.3.
- יש לפרק את הקלטת ולטבול את המגלשה לתוך PBS 0.1x (למשל, בשפופרת של 50 מ"ל) לשטיפה מהירה.
- יבש את המגלשה כמו בשלב 7.1.3.
8. סריקה לאיתור פלואורסצנטיות
- סרוק את השקופית לאיתור פלואורסצנטיות בשיא הפלואורסצנטיות המרבית של הפליטה עבור צבע פלואורסצנטי אדום רחוק בסורק עבור פלואורסצנטיות. צלם מספר תמונות של המיקרו-מערכים בפרמטרים שונים של סריקה, בדרך כלל על-ידי הורדת ערך רווח הלייזר.
הערה: הימנעו מכתמים רוויים (> 65,000 ספירות פלואורסצנטיות) – הם מחוץ לקנה המידה ועלולים לגרום לשגיאות כימות.
טבלה 1. רשימת הנוגדנים (ABS) וזני הציאנובקטריה המשמשים לייצור הציאנוצ'יפ.
| קוד Ab | אימונוגן (זן) | הזמנה | גידול | בינוני | תנאי תרבות |
| K1 | Anabaena sp. | נוסטוקלס | ידוע | BG11 וניטראט | 30ºC, אור רציף |
| K2 | Anabaena sp. | נוסטוקלס | ידוע | BG11o | 30ºC, אור רציף |
| K3 | מיקרוציסטיס פלוסקווה | כרוקוקלס | פלנקטוניק | BG11 | 28ºC, אור רציף |
| K4 | מיקרוציסטיס נובצ'קי | כרוקוקלס | פלנקטוניק | BG11 | 28ºC, אור רציף |
| K5 | מיקרוציסטיס ארוגינוזה | כרוקוקלס | פלנקטוניק | BG11 | 28ºC, אור רציף |
| K6 | Aphanizomenon ovalisporum | נוסטוקלס | פלנקטוניק | BG11o | 28ºC, אור רציף |
| K7 | Phormidium sp. | Oscillatoriales | בנטיק | BG11 | 18ºC, 16-8 photoperiod |
| K8 | Rivularia sp. | נוסטוקלס | בנטיק | צ'ו-ד | 18ºC, 16-8 photoperiod |
| K9 | Chamaesiphon sp. | כרוקוקלס | בנטיק | BG11 | 18ºC, 16-8 photoperiod |
| K10 | לפטולינגביה בוריאנה | Oscillatoriales | בנטיק | BG11 | 18ºC, 16-8 photoperiod |
| K11 | טוליפוטריקס דיסטורטה | נוסטוקלס | בנטיק | BG11o | 18ºC, 16-8 photoperiod |
| K12 | Aphanizomenon aphanizomenoides | נוסטוקלס | פלנקטוניק | BG11o | 28ºC, אור רציף |
| K13 | Nostoc sp. (אנטארקטיקה) | נוסטוקלס | בנטיק | BG11o | 13ºC, 16-8 photoperiod |
| K14 | Anabaena sp. | נוסטוקלס | בנטיק | BG11o | 13ºC, 16-8 photoperiod |
| K15 | Leptolyngbya sp. | Oscillatoriales | בנטיק | BG11 | 13ºC, 16-8 photoperiod |
| K16 | Tolypothrix sp. | נוסטוקלס | בנטיק | BG11 | 13ºC, 16-8 photoperiod |
| K17 | Planktothrix rubescens | Oscillatoriales | פלנקטוניק | ללא | ללא |