1. אנקפסולציה של תאים בהידרוג'לים תלת-ממדיים דמויי אלסטין (ELP)
- הכנת תבניות סיליקון
- השתמשו בניקוב ביופסיה בקוטר הרצוי כדי ליצור חורים ביריעת סיליקון בעובי 0.5 מ"מ וחתכו ריבוע סביב כל חור. חזור על הפעולה עבור מספר התבניות הרצוי.
הערה: ניתן להתאים את הקוטר והעובי של התבניות ליישום מסוים ולתנאי תרבית התא. בפועל, עבור תרביות תאים של 50 x 106 תאים/מ"ל, תבניות בעובי 0.5 מ"מ בקוטר 4 מ"מ ו-5 מ"מ מומלצות למיצוי DNA/RNA וחלבונים מספיקים, בהתאמה. עבור צביעה חיסונית, ניתן להשתמש בניקוב ביופסיה של 2 מ"מ כדי ליצור במקום זאת שלושה חורים סמוכים לכל תבנית מרובעת, כך שניתן יהיה להכתים שלושה משכפלים לכל באר.
- מוציאים את הניילון הנצמד מכל צד של התבנית הנפרדת עם פינצטה.
הערה: הימנעו ממגע עם משטח הסיליקון החשוף מכיוון שזיהום עלול לפגוע ביעילות מליטת הפלזמה בעתיד.
- בעזרת פינצטה, סדרו את אותו מספר של תבניות סיליקון חשופות וכיסויי זכוכית (מס' 1, קוטר 12 מ"מ) בשורות מתחלפות על מכסה הפוך של צלחת בעלת 48 בארות. לאחר השלמתה, לכסות את המכסה של צלחת 48-באר כדי למנוע זיהום.
- פלזמה חמצן לטפל בכל מכסה צלחת 48 בארות (כלומר, תבניות שקופיות זכוכית). מיד לאחר מכן, השתמשו במלקחיים כדי להפוך את תבנית הסיליקון על מכסה הזכוכית הסמוך. לחץ בחוזקה על התבנית כדי להבטיח הדבקה. תנו לתבניות לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה < >
הערה: משך הטיפול בפלזמת חמצן ישתנה בהתאם למכשיר בו נעשה שימוש. תנאים אופייניים למכשיר שלנו הם חלון לחץ גז בין 0.3-4 mbar, זרימת גז חמצן ב 20 ס"מ3/min, וחשיפה דגימה לפלזמה במשך 10-20 שניות.
- לעקר את התבניות על ידי autoclaving. אחסנו את התבניות בטמפרטורת החדר בסביבה סטרילית עד לשימוש.
הערה: ניתן לאחסן את התבניות בשלב זה ללא הגבלת זמן.
- הכנת תמיסת מלאי חלבון דמוית אלסטין
- הסר ELP שעבר ליופיליזציה מאחסון של 4°C. חממו את החלבון לטמפרטורת החדר לפני פתיחת הצינורית כדי להבטיח שלא ייבנה עיבוי על החלבון בשימוש חוזר.
- יש להמיס ELP במי מלח חוצצי פוספט (DPBS) של Dulbecco בטמפרטורה של 4°C עם תסיסה מתמדת (כלומר, מסתובבת) למשך הלילה.
הערה: ריכוז תמיסת מלאי ELP ידולל עוד יותר עם הוספת פתרון crosslinker ביחס נפחי המוגדר על ידי המשתמש. לדוגמה, עבור ריכוז ELP סופי של 3% (w/v), הכינו תמיסת מלאי ELP של 3.75% (w/v) שתדולל ביחס נפחי של 4:1 של תמיסת ELP:crosslinker. התאימו את הריכוז לפי הצורך ליישום הרצוי.
- מסנן סטרילי פתרון מלאי ELP באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן את ELP על קרח כאשר אינו בשימוש.
- בארון הבטיחות הביולוגית, מעבירים את התבניות הסטריליות באמצעות פינצטה סטרילית לצלחת תרבית רקמה בת 24 בארות.
- הכנת תמיסת מלאי טטרקיס (הידרוקסימתיל) פוספוניום כלוריד (THPC)
- יש לדלל THPC ב-DPBS ממש לפני השימוש. התאם את ריכוז תמיסת THPC בהתאם לריכוז ELP הסופי ויחס הקרוסלינקינג הרצוי.
הערה: עבור הפרוטוקול, ריכוז ELP סופי של 3% (w/v) ייעשה על ידי ערבוב תמיסת מלאי ELP עם תמיסת THPC ביחס נפחי של 4:1. יש לכוונן לפי הצורך.
- הוסף 2.6 μL של תמיסת THPC (80% במים) ל 997.4 μL של DPBS.
הערה: ריכוז זה של THPC מתאים ליחס סטויכיומטרי של 1:1 של קבוצות מתיל הידרוקסי על THPC ואמינים ראשוניים על חלבון ELP בעת ערבוב תמיסות ביחס נפחי 4:1 המתואר עבור הידרוג'ל ELP סופי של 3% (w/v). תמיסת THPC צמיגה וטיפות של תמיסה עשויות להידבק לצד קצה הפיפטה. לריכוזים מדויקים, הימנעו מטיפות כאלה בעת דילול ל-DPBS. לטהר את מיכל מלאי THPC עם גז חנקן כדי למנוע חמצון של פוספין ו inactivation של crosslinker.
- מערבלים את התמיסה כדי לערבב ולשמור על קרח.
- מסנן סטרילי את תמיסת מלאי THPC באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. דלל עוד יותר את תמיסת מלאי THPC עם DPBS סטרילי כדי להשיג יחסי הצלבה סטויכיומטריים נמוכים יותר (למשל, 0.5:1 או 0.75:1).
הערה: THPC רגיש לחמצן, ויש להשתמש בתמיסה המדוללת תוך מספר שעות לאחר ההכנה.
- נתק את התאים על ידי דגירה עם טריפסין-EDTA לתרחיף חד-תאי, גלול את התאים וספור את התאים המרחפים מחדש בתווך באמצעות המוציטומטר.
הערה: פרוטוקולים מדויקים עבור שלב זה יהיו תלויים במידה רבה בסוג התא הרצוי וביישום. עבור תאי האב העצביים המשמשים בפרוטוקול זה, בוצעה דגירה של 0.025% טריפסין-EDTA בטמפרטורת החדר במשך 1.5 דקות. התאים היו גלולות ב 200 x גרם במשך 2 דקות. להגדלת יכולת הקיום של התא, יש להשעות תאים בתנאים בינוניים רגילים. צפיפויות תאים אופייניות המשמשות לאנקפסולציה של תאים נעות בין 1 - 50 x 106 תאים/מ"ל של נפח הידרוג'ל סופי. יש לכוונן לפי הצורך.
- Aliquot את מספר התאים הרצוי לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי 1.5 מ"ל.
- צנטריפוגה את התאים ב~ 200 x גרם למשך 3 דקות. בזהירות, שאפו את הסופרנאטנט ושמרו את גלולת התא על קרח.
הערה: זה קריטי לשאוף לחלוטין את כל supernatant כדי למתן את דילול נוסף של ELP ו THPC crosslinker. מהירויות צנטריפוגה ספציפיות ישתנו בהתאם לסוג התא.
- השהה מחדש את גלולת התא בתמיסת מלאי ELP כך שהנפח יהיה 80% מהנפח הסופי (בהנחה שיחס 4:1 של תמיסת ELP:THPC). פיפטה מערבבת 20-25 פעמים כדי לייצר תערובת הומוגנית של התאים ו- ELP.
הערה: הימנע מאחיזה בתחתית הצינור כדי למתן את עליית הטמפרטורה ואת מעבר הפאזה הבא של ELP. כל תבנית 2 מ"מ עם שלושה משכפלים דורשת 7.5 μL של נפח סופי (כלומר, 6 μL של תמיסת מלאי ELP ו 1.5 μL של תמיסת מלאי THPC) מחולק שווה בשווה לשלושת החורים (כלומר, 2.5 μL נפח סופי לכל חור). עבור תבניות 4 ו 5 מ"מ, נפח סופי של 7.5 μL ו 15.5 μL נדרש, בהתאמה.
- הוסף פתרון מלאי THPC למתלי התא/ELP לקבלת הנפח הסופי הנותר של 20%. פיפטה מערבבים 20-25 פעמים ליצירת תערובת הומוגנית.
- מיד פיפטה את הנפחים הסופיים המתאימים של תערובת התא / ELP / THPC לתוך כל תבנית על ידי תנועה מעגלית. חזור על הפעולה עבור כל התבניות.
- דגרו על הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, ולאחר מכן דגירה נוספת בטמפרטורה של 37°C למשך 15 דקות.
הערה: תקופת הדגירה הראשונה תסייע להקל על קישור צולב ראשוני של ההידרוג'ל לפני העלאת הטמפרטורה לזו שמעל טמפרטורת התמיסה הקריטית הנמוכה יותר של ELP (LCST) וגרימת הפרדת הפאזה התרמית שלו.
- הוסיפו באיטיות 750 מיקרוליטר של תרבית תאים חמה לכל באר של צלחת 24 בארות, תוך הימנעות משיבוש הג'לים.
- לדגור את הידרוג'ל ב 37 ° C במשך 7 ימים.
הערה: שינויים בינוניים מלאים מומלצים כל 1-2 ימים, בהתאם לסוג התא. כדי להגביל את הלחץ על הג'ל, השתמש פיפטה פסטר זכוכית מודבק עם קצה פיפטה 200 μL בעת שאיפה מדיום מן הבאר.
2. אימונוציטוכימיה של תאים בהידרוג'לים ELP תלת-ממדיים
- הכן את תמיסת הקיבוע על ידי ערבוב 10 מ"ל 16% (w/v) paraformaldehyde (PFA) ב 30 מ"ל DPBS. מחממים את התמיסה ל 37 מעלות צלזיוס.
- שאפו את המדיום מהצלחת בת 24 הבארות ושטפו בעדינות עם 1 מ"ל של DPBS.
- מוסיפים 750 מיקרוליטר של תמיסת הקיבוע לכל באר ודגרים בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות. אין להשתמש באינקובטור תרביות הרקמה כדי למנוע זיהום של תרביות אחרות באדי PFA.
- שאפו בזהירות את פתרון הקיבוע מכל באר, השליכו את ה- PFA למיכל פסולת מסוכנת מתאים.
זהירות: חשיפה ל-PFA עלולה לגרום לגירוי בעור ובעיניים. יש ללבוש כפפות/משקפי בטיחות ולעבוד במכסה מנוע של אדים כימיים.
- הוסף 1 מ"ל של DPBS לכל דגימה. שאפו מיד את ה-DPBS והשליכו למיכל פסולת PFA.
- שטפו את הדגימות פעמיים עם 1 מ"ל של DPBS למשך 10 דקות כל אחת.
הערה: ניתן לאחסן דגימות ב- DPBS ב 4 ° C עד שבוע לאחר איטום הצלחת עם Parafilm.
- חדיר כל דגימה עם 750 μL של תמיסת permeabilization (100 מ"ל של DPBS ו 0.25 מ"ל של Triton X-100; PBST) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר על נדנדה ב-15 סל"ד.
- שאפו ל-PBST והוסיפו 750 מיקרוליטר של תמיסת חסימה (95 מ"ל PBS, 5 גרם אלבומין בסרום בקר (BSA), 5 מ"ל בסרום ו-0.5 מ"ל טריטון X-100) לכל דגימה. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 3 שעות על נדנדה ב 15 סל"ד.
הערה: התמיסה החוסמת צריכה להכיל נסיוב מהזן הפונדקאי שבו גידלו את הנוגדנים המשניים (למשל, עז, חמור) וסוננו סטרילית דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר לפני השימוש.
- הכן את פתרון דילול נוגדנים (97 מ"ל של DPBS, 2.5 גרם של BSA, 2.5 מ"ל של סרום (מאותו מין מארח שממנו EPL מוכן), ו 0.5 מ"ל של Triton X-100). לדלל את הנוגדן הראשוני באמצעות תמיסת דילול נוגדנים ולהוסיף 500 μL של התמיסה לכל דגימה. אוטמים את הצלחת עם Parafilm ודגרים לילה ב 4 °C על נדנדה.
הערה: הנוגדנים הראשוניים Nestin ו-Sox2 דוללו בקנ"מ 1:400 בתמיסת דילול נוגדנים מהריכוז המקורי של היצרנים.
- שאפו את תמיסת הנוגדנים מכל דגימה ושטפו את הדגימות עם PBST למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר על נדנדה ב-15 סל"ד. חזרו על שלב הכביסה 3 פעמים.
- לדלל את הנוגדנים המשניים ומלאי DAPI של 5 מ"ג/מ"ל (1:2,000) באמצעות תמיסת דילול הנוגדנים ולהוסיף 500 מיקרוליטר של התמיסה לכל דגימה. מכסים את צלחת 24 הקידוחים ברדיד אלומיניום ודגרים לילה ב 4 ° C על נדנדה.
הערה: מכיוון שהנוגדנים המשניים רגישים לאור, הדגימות חייבות להיות מוגנות מפני הלבנה לכל השלבים הבאים. נוגדנים משניים נגד עכברים ועז נגד ארנבים דוללו בקנ"מ 1:500 בתמיסת דילול נוגדנים מהריכוז המקורי של היצרנים.
- שאפו את תמיסת הנוגדנים מכל דגימה ושטפו את הדגימות עם PBST במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על הנדנדה. חזרו על שלב הכביסה 3 פעמים.
- מקם טיפה של אמצעי הרכבה קשיח על פני השטח של מגלשת זכוכית. בעזרת מלקחיים, מסירים את עודפי התמיסה מהתבנית על ידי הדבקה קלה של קצה התבנית על מגבת נייר. מניחים בזהירות את התבנית הפוכה על אמצעי ההרכבה ונמנעים מהחדרת בועות.
- אפשר למדיום ההרכבה להתקשות במשך 48 שעות בטמפרטורת החדר. אחסנו את הדגימות בטמפרטורת החדר או 4°C. אפשרו למדיום ההרכבה להתארגן במלואו למשך 48 שעות לפני שההדמיה כאינדקס השבירה של התווך ישתנה במהלך ההתקשות. אטמו את הדגימות למגלשת כיסוי הזכוכית עם לק שקוף כדי להפחית זיהום או תנועת דגימה.
- דמיינו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.
