$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. צימוד פפטיד נוגדנים
הערה: חומצה כולית המקושרת ל-NLS (ChAcNLS) ניתנת לסינתזה בכל יצרן פפטידים מסחרי או פלטפורמת שירות סינתזת פפטידים המסונפת לאוניברסיטה.
- בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.7 מ"ל, הכינו תמיסת 10 מ"ג/מ"ל (~1 מ"ג נוגדנים סה"כ) של 7G3 במי מלח חוצצים פוספט (PBS), pH 7.6.
- להמיס sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC) ב dimethyl sulfoxide (DMSO) בריכוז של 5-10 mM. ערבול התמיסה עובד בצורה הטובה ביותר על מנת להשיג פירוק מלא.
- הוסף לצינור המכיל 7G3 את תמיסת הגופרית-SMCC המומסת (בדרך כלל בין 5-20 μL בהתאם ליחס המולרי הרצוי של sulfo-SMCC-to-7G3). מומלץ לבדוק יחסי סולפו-SMCC-ל-7G3 של 10, 25 ו-50 ל-1. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
- לטהר ולרכז את 7G3 derivatized maleimide-derivatized באמצעות מכשיר ultrafiltration חילופי חיץ PBS, pH 7.0. צנטריפוגה ברזולוציה של 8,000 x גרם למשך כ-5 דקות. יש להשליך את הזרימה ולמלא שוב PBS, pH 7.0 וצנטריפוגה.
- בצע זאת 7-8 פעמים כדי להחליף את המאגר לחלוטין. שחזר את חלבון 7G3 המרוכז על ידי הנחת התקן המסנן הפוך בצינור מיקרוצנטריפוגה נקי. צנטריפוגה למשך 2 דקות במהירות של 1,000 x גרם. נפח ההתאוששות צריך להיות כ 0.3 מ"ל.
- בצינור המכיל את 7G3 המופעל על ידי מלימיד, הוסף עודף מולארי פי 2 של ChAcNLS ביחס סולפו-SMCC-ל-7G3 ששימש בשלב הקודם ודגור לילה ב -4 מעלות צלזיוס. לדוגמה, אם נעשה שימוש ביחס סולפו-SMCC-ל-7G3 של 10 ל-1, השתמש ביחס ChAcNLS-to-7G3 של 20 ל-1. אין לשנות באופן משמעותי את עוצמת הקול הכוללת.
הערה: למרות ChAcNLS אינו גורם משקעים במהלך תהליך הצמידה, זוהי אפשרות שיכולה להתרחש עם פפטידים אחרים. שימו לב לצינור במהלך התגובה לסימנים של משקעים, אשר נגרמת ככל הנראה כאשר פפטידים הם הידרופוביים. במקרים אלה, ייתכן שכדאי לבחון מחדש את הפפטיד המעניין על מנת לתכנן שינויים שיספקו הידרופיליות מוגברת.
- רכז את 7G3-ChAcNLS באמצעות מכשיר אולטרה-סינון לריכוז הרצוי ולחילופי החיץ הרצויים ב-PBS pH 7.4 (ראה שלב 1.4). תפוקת ההתאוששות של סך החלבון צריכה להיות ≥ 75% מחומר המוצא המקורי.
- בצע אלקטרופורזה של ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE) כדי להעריך את המועמדים 7G3-ChAcNLS שנבנו באמצעות ג'ל פוליאקרילאמיד 12% (מספק הפרדה מספקת של שרשראות כבדות וקלות מצומדות ChAcNLS משרשראות לא מצומדות). יש לערבב 10 מיקרוגרם של 7G3-ChAcNLS במאגר טעינת PAGE המכיל 2 μL β-מרקפטואתנול ולהעמיס לבאר.
- הגדר את המתח המתאים (120 V למשך שעה אחת עבור ג'ל 12%) והפעל את האלקטרופורזה. עצור את האלקטרופורזה כאשר חזית הצבע של קומאסי מגיעה לתחתית הג'ל.
הערה: אל תתנו לחזית הצבע של קומאסי לברוח מהג'ל.
- יש להסיר את הג'ל ממכשיר האלקטרופורזה ולשטוף בתמיסת עיכוב המכילה 10% V/V חומצה אצטית קרחונית ו-20% V/V מתנול.
- צלם תמונה של הג'ל ועם סרגל ומדוד את המרחק (ס"מ) שהועבר עבור התקנים והצמידות 7G3. חשב את ערך מקדם השמירה (Rf), שהוא המרחק המועבר חלקי אורך הג'ל (מהמקום שבו החלבון נטען לחזית הנדידה של קומאסי). שרטט את המשקל המולקולרי (MW) ביומן כנגד ערכי Rf מכל תקן חלבון ובצע אקסטרפולציה של גודל הצמידות 7G3.
- חשב את מספר הפפטידים לכל נוגדן על ידי חלוקת ההפרש ב- MW בין 7G3 מצומד ל- 7G3 ללא שינוי ב- 1768.5 g/mol (MW של ChAcNLS).
- צלם תמונות דיגיטליות של הג'ל המוכתם בקומאסי ובצע ניתוח דנסיטומטריה. בשלב זה, בחירת מועמד מוביל יכולה להתבסס על AC עם המספר המרבי של מולקולות ChAcNLS שאינו מכיל מינים מצטברים משמעותיים.
2. מיקרוסקופ קונפוקלי להערכת הצטברות תוך תאית
הערה: חשוב לבדוק את הסלקטיביות התאית של הצטברות תוך-תאית של mAbs מהונדס-פפטיד לפני פיתוח פורמולציות עם מטען של עניין. מכיוון של-Tat יש גם נטייה לחדירת תאים לא ספציפיים, כדאי לנתח תחילה הצטברות תוך-תאית וסלקטיביות תאים לפני ביצוע צעדי פיתוח יקרים עם מטע"דים יקרים. מסיבה זו, הליך 1 צריך גם לשנות mAbs בקרה ספציפי איזוטיפ לא רלוונטי. עבור שאר הפרוטוקול, אנו נעבוד עם ACs שונה עם 10 מולקולות ChAcNLS לכל נוגדן. סכמה הכוללת שלבים מרכזיים עבור הליכים 2 ו-3 מתוארת באיור 1.
זהירות: שלב זה של הפרוטוקול כולל טיפול ומניפולציה של פרפורמלדהיד. פעל בהתאם להוראות היצרן בעת הטיפול.
- טפל בתאי מטרה TF-1a עם 200 ננומטר של 7G3-ChAcNLS כולל mAbs בקרה שונה. לדגור 5 x 106 תאים חיוביים אנטיגן עם מצומדים במשך 1 שעה ב 37 ° C.
- לאחר שעה אחת, יש להסיר את הסופרנאטנט ולשטוף עם 1 מ"ל 3x ב-PBS קר כקרח. מוסיפים חומרי הדפסה טריים ודגרים למשך שעה נוספת בטמפרטורה של 37°C.
- לאחר השעה הנוספת, להסיר supernatant ולשטוף 3x ב 1 מ"ל PBS קר כקרח. הוסף 0.5 מ"ל של PBS המכיל 0.25% טריפסין וחומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA) ב 37 ° C במשך 3 עד 30 דקות.
הערה: במהלך בדיקות פיילוט ראשוניות מומלץ לא טריפסיניזציה של תאים על מנת לקבוע את ההבדלים בהצטברות AC תוך תאית. פרוטוקול זה מקדם את השימוש בטריפסין, ואנו מדגימים כיצד הוא משפר את הערכת יעילות ההצטברות התוך-תאית של מועמדים שונים למזגן.
- בדוק את הזמנים השונים לדגירה על ידי בדיקה חזותית של כל התאים מנותקים. בנוסף, לדגור על אליציטוטים של תאים עם פתרונות צביעה כדאיות ולבצע ניתוח ציטומטרי זרימה כפי שתואר קודם לכן.
- נטרול טריפסין עם 1.5 מ"ל של תרבית תאים RPMI 1640 מדיה/10% סרום בקר עוברי. תאי צנטריפוגות ב 500 x גרם במשך 5 דקות, להסיר supernatant, ולשטוף 3x ב 0.5 מ"ל PBS קר כקרח.
- תקן תאים ב- PBS של 0.5 מ"ל המכילים 1% פרפורמלדהיד ו- 1% סוכרוז על קרח למשך 30 דקות. שטוף תאים 3x ב- 0.5 מ"ל PBS קר כקרח וצנטריפוגה ב 250 x גרם למשך 5 דקות. חלחל תאים ב- PBS של 0.5 מ"ל המכיל 0.15% Triton X-100 למשך 5 דקות על קרח. יש לשטוף תאים ב-PBS קר כקרח ולחזור על הצנטריפוגה.
- תאי השהיה ב-PBS של 0.1 מ"ל המכילים 2 מיקרוגרם/מ"ל (או הריכוז המומלץ על-ידי היצרן) של נוגדן רב-שבטי משני Fc אנטי-מורין (ספציפי לאיזוטיפ) מצומד ל-AlexaFluor 647 למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחושך.
- צנטריפוגה ב 250 x גרם במשך 5 דקות ולשטוף תאים 3x ב 0.5 מ"ל PBS קר כקרח. תאי השהיה ב- 0.5 מ"ל PBS.
השהה: ניתן לאחסן תאים במקרר.
הערה: זה חיוני כדי לבחור נוגדן משני המזהה את האיזוטיפ הנכון של mAb של עניין. AF647 נבחר בגלל פליטת האינפרא אדום הרחוק שלו, שאינה מפריעה לצביעת פרופידיום יודיד (PI) של הגרעין.
- הוסף PI לריכוז של 10 מיקרוגרם / מ"ל למכל עם תאים. לאחר מכן, הרכיבו 1 x 105 תאים על שקופיות זכוכית באמצעות מדיית הרכבה וכסו בכיסוי זכוכית.
- בחן תאים עם מטרת טבילת שמן Plan Apo 60X NA 1.42 במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך לסריקת לייזר. זהה פלואורסצנטיות PI באמצעות לייזר ארגון 488 ננומטר ומנסרת הסריקה הספקטרלית המוגדרת ל- 600 - 650 ננומטר. עבור AF647 פלואורסצנטיות השתמש בלייזר הליום-ניאון 633 ננומטר ומנסרת סריקה ספקטרלית המוגדרת ל- 650 - 700 ננומטר. אסוף פליטות פלואורסצנטיות מ-PI ומ-AF647 ברצף.
הערה: השתמש באותה הגדרה לאורך כל ההערכה וההשוואה של התאים. עם זאת, יהיה עליך להתאים הגדרות עבור תאים טריפסיניים בהשוואה לתאים שאינם טריפסינים.
- השתמש בתוכנת מיקרוסקופ כדי להשיג תמונות. אסוף תמונות באמצעות מקטעים אופטיים אופקיים טוריים של 1,024 x 1,024 פיקסלים עם ממוצע קו פי 2 שצולם במרווחים של 0.5 מיקרומטר לאורך כל עובי התא. הציגו את התמונות כהקרנות z מוערמות מארבע פרוסות רצופות בעוצמת הפלואורסצנטיות המרבית.
- נתח תאים באמצעות תוכנת מיקרוסקופ. רשום את דפוס הפיזור התאי של המצומדות. באופן ספציפי, להעריך אם פלואורסצנטיות תוך תאית בציטופלסמה מקובצת וקרובה לפני השטח של התא או מפוזרת והומוגנית. כמו כן, להעריך את עוצמת הפלואורסצנטיות היחסית לכל תא.
