כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת קטטר לפני ניתוח סטריאוטקסי
- חתכו צנתרי PE50 (באורך 6 ס"מ) שישמשו לחיבור הצינורית עם משאבות אוסמוטיות (ראו איור 1). מלאו צנתרי PE50 בנוזל מוחי מלאכותי (aCSF) ואטמו את שני קצוות הצנתרים. יש לשמור את הצנתר על 4°C עד לשימוש.
2. השתלת קנולה על ידי סטריאוטקסיה
- לבצע את הניתוח בתנאים סטריליים. לעקר את כל כלי הניתוח והחומרים על ידי autoclaving. נקו היטב את המנגנון הסטריאוטקסי ואת אזור העבודה וחיטאו בתמיסת אתנול 70%. יש ללבוש מסכה כירורגית, מצנפת לשיער וכפפות סטריליות.
- הרדימו חולדות על ידי הזרקת תמיסה תוך-צפקית (כלומר) של קטמין וקסילזין (100 מ"ג/ק"ג ו-10 מ"ג/ק"ג, בהתאמה). יש לאשר את פעולת ההרדמה על ידי בדיקת התנועה לאחר צביטה עדינה בבוהן.
- יש להזריק תרופה נוגדת דלקת לא סטרואידית (Meloxicam; 1 מ"ג/ק"ג) תת עורית (s.c.) לחיה המורדמת לפחות 30 דקות לפני הניתוח.
- לגלח את הראש של החיה באמצעות קוצצים ולחטא את העור שלוש פעמים עם פתרון של chlorhexidine gluconate 2% ואלכוהול isopropyl 2%. יש למרוח משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
- הניחו את החיה על מסגרת סטריאוטקסית עם מוטות האוזניים. תקן צינורית אחת על זרוע המחזיק של המסגרת הסטריאוטקסית. יש להזריק (s.c.) חומר הרדמה מקומי (bupivacaine (1.5 מ"ג/ק"ג) ולידוקאין (1.5 מ"ג/ק"ג) בחלק העליון של הראש. ההרדמה נשמרת במהלך כל ההליך על ידי הנחת חרוט אף המספק איזופלורן 3%. צריך לעטוף את כל התחום הכירורגי, אבל זה לא נעשה כאן כדי להדגים את הטכניקה טוב יותר.
- בצע חתך של 3 ס"מ בחלק העליון של הראש עם אזמל. התקן 4 מלחציים סביב החתך כדי להשאיר את הגולגולת נקייה. בעזרת מספריים בעלי קצה עגול, יוצרים כיס (2X2 ס"מ2) מתחת לעור בין השכמות של החיה.
- לגרד את periosteum של הגולגולת עם להב. החל כרית גזה על הגולגולת אם הוא מדמם.
- ודא שהגולגולת שטוחה ומיושרת היטב על המסגרת הסטריאוטקסית. כדי לוודא שהגולגולת שטוחה, בדקו את קואורדינטות הגובה בברגמה ובלמדא. קח את קואורדינטות bregma שישמשו כנקודת התייחסות.
- החל מהברגמה, חשב את הקואורדינטות של שתי הצינוריות המדריכות שיושתלו דו-צדדית בהיפוקמפוס (אנטרופוסטרי: - 0.42 ס"מ; בינוני: ± 0.30 ס"מ; דורסו-ונטרלי: - 0.28 ס"מ על פי אטלס המוח של חולדות פקסינוס וווטסון). ציין את מיקום הצינורית עם סמן.
- קדח חור (0.5 מ"מ) בגולגולת בנקודת ההשתלה של שתי הצינוריות. קדח שני חורים נוספים כ -5 מ"מ מעל ומתחת לנקודות אלה כדי להכניס ברגים שימצקו את הצינורית בעת יישום מלט דנטלי.
- חותכים קצה אחד של הצנתר שהיה מלא בעבר באזמל עם אזמל ומכניסים אותו לזרוע הזווית של הצינורית. לתקן את הצינורית הראשונה עם מלט שיניים. הימנעו מהנחת מלט דנטלי סביב המיקום על הצינורית השנייה.
- תן מלט שיניים להתייבש במשך 2 - 3 דקות, ולאחר מכן להסיר את היד מחזיק מן הצינורית הראשונה, ולתקן את הצינורית השנייה בו. חזור על שלבים 2.11 ו- 2.12. שים צינורית דמה על שתי צינוריות המנחה. ודא כי הצינורית המוצצת והצינורית המנחה הן באותו אורך כדי למנוע חדירת רקמות וחסימה של הצינורית.
- הכנס את הקצה החופשי של שני הצנתרים לכיס שנעשה בעבר בין השכמות של החיה. הסר את מלחציים ותפר את העור עם חוט תפר 4-0.
הערה: צינורית המדריך העליונה חייבת להיות נגישה לעירויי Aβo הקרובים.
- הוציאו את החיה מהמסגרת הסטריאוטקסית והחזירו אותה לכלוב שלה. במהלך ההתאוששות שלאחר הניתוח, הניחו את הכלוב על שמיכת מים מחוממת עד שבעל החיים יתעורר. הכלוב צריך להיות בחלקו על הפד כדי שהחולדה תוכל לברוח מהחום במידת הצורך. עקוב אחר בעל החיים כל הזמן עד שהוא חוזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה עצם החזה.
- להחזיר חולדות למתקן בעלי חיים כדי להתאושש מהניתוח למשך 10 ימים תחת מעקב צמוד.
הערה: אין להחזיר בעל חיים שעבר ניתוח לחברתם של בעלי חיים אחרים עד להחלמה מלאה. Meloxicam (1 מ"ג / ק"ג) ניתנת פעם ביום במשך יומיים לאחר ניתוח לטיפול בכאב.
3. התקנת משאבה אוסמוטית
- יום לפני ההתקנה, יש למלא משאבות אוסמוטיות בנוגדן 6E10 (1 מ"ג/מ"ל; 100 מיקרוליטר) ולשלוט בנוגדן IgG1 (1 מ"ג/מ"ל; 100 מיקרוליטר) בהתאם להוראות היצרן בתנאים סטריליים. שמרו את המשאבות במים מזוקקים סטריליים בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה כדי להפעיל משאבות.
- הרדימו חולדות עם איזופלורן 3% כדי להתקין משאבות אוסמוטיות (0.5 מיקרוליטר/שעה למשך 7 ימים). יש לגלח בין השכמות ולחטא את העור בתמיסה של כלורהקסידין גלוקונאט 2% ואיזופרופיל אלכוהול 2%. בצע חתך של 2 ס"מ עם אזמל בין השכמות כדי לאתר את צנתרי PE50 המחוברים לצינורית המנחה.
- חתכו את קצה צנתרי PE50 המכילים מלט דנטלי בעזרת אזמל. חבר את המשאבות האוסמוטיות לצנתרי PE50 והוסף מעט מלט דנטלי בצומת המשאבה והצנתר כדי לאבטח את החיבור.
- תפרו את העור בחוזקה עם חוט תפר 4-0. החזירו את בעל החיים לכלוב שלו על כרית מים מחוממת. שימו לב שבעל החיים מתעורר במהירות מהרדמה איזופלורנית (כ-5 דקות).
הערה: הניתוח אורך כ-5 עד 10 דקות.
4. חליטות Aβo בחולדות ערות ונעות בחופשיות
- הכינו את תמיסת Aβo (0.2 מיקרוגרם/μl). אפשר ל-Aβo לצבור באופן דינמי וספונטני במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר לפני העירוי.
- התקן שני מזרקים 10 μl על משאבת עירוי. ממלאים את המזרקים ב-5 מיקרוליטר מים מזוקקים סטריליים. חתכו שני צנתרים PE50 לאורך של כ-60 ס"מ בעזרת אזמל. מלאו את שני הצנתרים במים מזוקקים סטריליים באמצעות מזרקים של 1 מ"ל ומחטים של 21 גרם.
- שמור את מזרקי 1 מ"ל בקצה אחד של הצנתר וחבר את הקצה השני למזרקי המילטון. הסר את מזרקי 1 מ"ל ובדוק שאין בועות אוויר בתוך הקטטרים.
- הכנס את הצינורית הפנימית בקצה צנתרי PE50. בעזרת מים מזוקקים סטריליים, ממלאים את הצינורית הפנימית המחוברת לצנתרי PE50 עד 1 מיקרוליטר על מזרקי המילטון. צור בועת אוויר על ידי משיכת הבוכנות לאחור עד 2 מיקרוליטר.
- ערבבו את תמיסת Aβo על ידי פיפטינג למעלה ולמטה באמצעות קצה של היצמדות מינימלית. יש להימנע מיצירת בועות במהלך הערבוב. מלא את שתי הצינורות הפנימיים בתמיסת Aβo של 1.5 μl על ידי משיכת הבוכנות לאחור עד 3.5 μl.
- צרו קווים עם טוש לפני ואחרי בועת האוויר בשני הצנתרים. זה משמש מחסום לעירוי מתמשך. לעירוי, הביאו את הכלוב ליד משאבת העירוי והסירו את הכיסוי שלו.
- הניחו את החולדה בחיבוק וגרדו בחוזקה את זרוע החולדה סביב צווארה כדי לשתק את ראש החולדה. הסר את צינורית הדמה משתי צינוריות המנחה. הכנס את הצינורית הפנימית שהוכנה קודם לכן בצינורית המנחה. ודא שהם מוכנסים במלואם ומקובעים היטב לבסיס צינורית המנחה.
- שחררו את החולדה מההתכרבלות והחזירו אותה לכלוב שלה כדי להגביל את לחץ המחלוקת. עקוב מקרוב כדי לוודא שהקטטרים אינם מתפתלים זה לזה והעירוי נעשה כראוי.
- הפעל את משאבת העירוי. הזריקו 1 μl של תמיסת Aβo בקצב של 0.1 μl/min (10 דקות). במהלך העירוי, בדקו שבוכנה המזרק נעה מ-3.5 מיקרוליטר ל-2.5 מיקרוליטר ושבועת האוויר בשני צנתרי PE50 נעה ברציפות.
- השאירו את הצינורית הפנימית במקומה למשך 5 דקות נוספות לאחר העירוי כדי לאפשר דיפוזיה יעילה של תמיסת Aβo. החזירו את החולדה להתכרבלות כדי להסיר את הצינורית הפנימית ואת צינורית ההנחיה הסגורה כדי למנוע ריפלוקס של התמיסה המוזרקת. השתמשו בצינורית דמה שעוצרת ממש לפני זרוע הזווית של הצינורית. להחזיר את החיה לכלוב שלה.
- חזור על עירוי Aβo פעם ביום במשך 6 ימים רצופים. הרדימו את בעל החיים על ידי עריפת ראש.
