$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. ייצור אימונופרוב קיבולי ופונקציונליזציה
- חתכו חוט פלטינה מצופה פרפלואורואלקוקסי (PFA) באורך 25 ס"מ (ראו טבלת חומרים) והפשיטו כ-5 מ"מ של ציפוי PFA מקצה אחד באמצעות אזמל, תוך זהירות שלא לחתוך לחוט הפלטינה.
- הכנס את הקצה המופשט של חוט הפלטינה לסיכת מחבר זכר מצופה זהב בקוטר 1 מ"מ וכווץ את שיני סיכת המחבר סביב הקצה המופשט של חוט הפלטינה באמצעות צבת אף מחט (ראה טבלת חומרים).
- הלחמת את חוט הפלטינה לסיכת המחבר המצופה זהב. היזהר לא להשתמש כמות מוגזמת של הלחמה.
- הכינו תמיסת דופמין על ידי המסת 50 מ"ג של דופמין הידרוכלוריד ב-50 מ"ל של 10 מ"מ מלח חוצץ פוספט (PBS, pH 6.0) על ידי ערבוב.
- לאחר שהדופמין מומס לחלוטין, הניחו את קצה חוט הפלטינה בכלי המכיל PBS טרי בתוספת דופמין. חבר פין מחבר זהב לתעלה של במת הראש (ראה טבלת חומרים).
- חבר את אלקטרודת דיסק הכסף כלוריד (AgCl) (אלקטרודת הקרקע, ראה טבלת חומרים) לתעלת הקרקע בבמת הראש. מניחים את דיסק AgCl בכלי המכיל PBS בתוספת דופמין וחוט פלטינה; יש להיזהר רק לטבול את אלקטרודת הדיסק ולא בכל אורך של החוט או ההלחמה. חבר חוט תיל לערוצי הייחוס של במת הראש לפני שתמשיך.
- פתח את התוכנה האינטראקטיבית לרכישת נתונים (ראה טבלת חומרים). הכן פרוטוקול פוטנציאל פקודת אלקטרודפוזיציה של שן מסור עם הפרמטרים הבאים: פוטנציאל התחלה = −0.6 V; פוטנציאל קצה = +0.65 V; קצב סריקה = 0.04 V∙s-1; משך התצהיר = 420 שניות. התחל את פרוטוקול תצהיר פולידופמין, וודא שכל החוטים מחוברים כראוי.
- לאחר השלמת תצהיר פולידופמין, להסיר את גלולת הקרקע AgCl ואת קצה חוט הפלטינה מן הכלי, נזהר לא להפריע את קצה אלקטרודת חוט פלטינה. מניחים את קצה החוט לתוך מיקרו-צינור המכיל PBS (pH 7.4) למשך 2-5 דקות בזמן הכנת תמיסת הנוגדנים; ודא שקצה החוט אינו בא במגע עם הצדדים או התחתית של המיקרו-צינור.
הערה: פתרון נוגדנים יכול להתבצע במהלך תצהיר פולידופמין; עם זאת, אין לדלג על העברת חוט הפלטינה מהכלי המכיל דופמין למיקרו-צינור של PBS לאחר שקיעת פולידופמין.
- הכינו את תמיסת הנוגדנים. שלב את נוגדן העניין עם PBS (pH 7.4) ביחס של 1:20 בכלי בגודל מתאים (למשל, מיקרו-צינור).
הערה: נוגדן חד שבטי אנטי-נוירופפטיד Y (anti-NPY) (ראה טבלת חומרים) המשמש כאן היה aliquoted ב 1 מ"ג / מ"ל; הכנת נוגדנים לדוגמה כאן תהיה 4 μL של נוגדנים ל 76 μL של PBS.
- השרו את קצה הפולידופמין של אלקטרודת הפלטינה בתמיסת נוגדנים למשך שעתיים לפחות בטמפרטורת החדר, וודאו שוב שקצה חוט הפלטינה תלוי בתמיסה ולא מונח על המשטח הפנימי של המיקרו-צינור.
הערה: יישום לאחרונה של טכניקה זו העדיף שימוש באלקטרודת חוט פלטינה מיד לאחר שלב זה במקום אחסון רטוב או יבש לשימוש מאוחר יותר.
- לאחר השריית תמיסת הנוגדנים, שטפו בקצרה את קצה האימונופרוב הקיבולי (CI probe) המתפקד לאחרונה ב-PBS (pH 7.4). הגשושית מוכנה כעת לשימוש.
2. מערך ניסיוני לזיהוי ומדידה חוץ גופית של פפטיד
- הכניסו את הקצה הפונקציונלי של הגשושית לתא הזרימה, תוך הקפדה שלא להפריע לקצה האלקטרודה בשום צורה, שכן הדבר עלול לפגוע בקצה החישה של הבדיקה.
הערה: תא הזרימה נוצר על ידי יציקת אלסטומר סיליקון (ראה טבלת חומרים) לתוך צלחת תרבית 35 מ"מ עם מילוי חלל מוארך במרכז המנה. לאחר ההתקשות, צורת הביצית מוסרת מהאלסטומר. לאחר מכן התא מאוחה עם מי מלח חוצצים טריס (TBS) ומאפשר קצב זרימה של 3 מ"ל/דקה. ודא שהזרימה והיציאה שומרות על רמת הנוזל בתא, כך שלא נצפתה פעולת גאות ושפל של הסופרפוסט. הזרימה חייבת להישאר במקומה כל עוד הגשושית CI נמצאת בשימוש.
- לפני הבדיקה הניסיונית הראשונה, בצע ריצה סטנדרטית של TBS כדי להתנות את הגשושית CI. הגדר את פרוטוקול מתח הפקודה הבא: פוטנציאל צעד חיובי = +100 mV; פוטנציאל צעד שלילי = −5 mV; משך שלב = 20 אלפיות השנייה; משך הרכישה = 600 s.
הערה: חשוב לאפשר שיווי משקל של הגשושית בשלב הראשוני של פוטנציאל פיקוד הרכיבה לפני איסוף הנתונים.
- צור פתרון של הפפטיד של עניין באמצעות אותו TBS כדי לשמור על הרכב superfusate. הגדירו מערכת סעפת שבה ניתן להחליף את הסופר-פוזאט בין TBS ל-TBS בתוספת פפטיד מבלי להכניס בועות למערכת הצינורות או לתא הזרימה.
הערה: במחקר הנוכחי נעשה שימוש בפפטיד NPY חזירי סינתטי (ראו טבלת חומרים).
- הגדר את פרוטוקול רכישת הנתונים עם חישת פפטידים באמצעות פרמטרים סטנדרטיים של TBS (ראה שלב 2.2).
הערה: ביישום זה, משך כל ניסוי היה 360 שניות (120 שניות TBS, 120 s תוספת פפטיד TBS, 120 s TBS).