טכניקת מבחנה לחקר סחר בקולטן גלוטמט בתאי עצב בהיפוקמפוס

תקציר

מקור: Chiu, A. M., et al. גישת הזנת נוגדנים לחקר סחר בקולטן גלוטמט בתרבויות היפוקמפוס ראשוניות מנותקות. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים גישה של הזנת נוגדנים לחקר הסחר של קולטני גלוטמט בתרביות עצביות ראשוניות בהיפוקמפוס. גישה זו מאפשרת תצפית על אוכלוסיות קולטנים הן בפלזמה והן בקרומים הפנימיים. הבחנה בין תת-קבוצות אלה מושגת על ידי תיוג הקולטנים לפני ואחרי חדירת הממברנה, תוך שימוש באותו נוגדן ראשוני אך נוגדנים משניים מצומדים לפלואורופורים שונים.

פרוטוקול

1. הכנה לפני התיוג

1. הכנה ותחזוקה של תרביות היפוקמפוס ראשוניות
   1. הכינו תרביות היפוקמפוס ראשוניות בצפיפות של 150,000 תאים המצופים על כוסות כיסוי 18 מ"מ מצופות פולי-D-ליזין (0.1 מ"ג/מ"ל). מדריכים מצוינים להכנת תרבית עצבית מנותקת זמינים.
      הערה: במידת הצורך, ניתן לטפל בתרביות עם ציטוזין אראבינוסיד (Ara-C, 10 מיקרומטר מימים במבחנה 1 [DIV1]) כדי למנוע התפשטות גלייה בתכשיר.
      הערה: ניתן להשתמש בריאגנטים חלופיים לציפוי כגון פיברונקטין (1 מ"ג/מ"ל) או למינין (5 מיקרוגרם/מ"ל) במקום פולי-D-ליזין.
   2. לשמור על תרביות באינקובטור תאים בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂ ב-2 מ"ל/באר של מדיה נוירובזאלית בתוספת B27 ו-2 mM L-גלוטמין.
      הערה: ניתן להשתמש בתחליפי L-גלוטמין (למשל, גלוטמקס), אם רוצים.
   3. על בסיס שבועי, להסיר מחצית נפח המדיה ולהחליף באותו נפח של מדיה נוירובזאלית משלימה.
2. אופציונלי: העברה של קולטנים עם מוטציה ו/או אפיטופ
   הערה: תאי עצב צריכים להיות נגועים לפחות 3-4 ימים לפני נקודת הזמן של הניתוח כדי לאפשר ביטוי קולטן. השימוש בתאי עצב צעירים (DIV6-9) מביא ליעילות טרנספקציה טובה יותר מאשר תאי עצב ישנים יותר (DIV15-20), אך ניתן להשיג מספר מספיק של תאים נגועים (>20) ללא קשר ל-DIV המופעל.
   1. עבור כל באר של צלחת 12 בארות, לדלל 1.5 מיקרוגרם של פלסמיד המכיל את המבנה של עניין ב 100 μL של מדיה נוירובזאלית טרייה ללא B27 או תוספת גלוטמין בצינור מיקרוצנטריפוגה ולערבב על ידי מערבולות במהירות.
      הערה: עבור transfection מוצלח, זה קריטי כי המדיה neurobasal בשימוש הוא טרי ככל האפשר, באופן אידיאלי פחות מ 1 שבוע לאחר פתיחת הבקבוק.
   2. בצינור מיקרוצנטריפוגה שני, יש לערבב 1 μL של מגיב ליפופקציה מתאים ב-100 μL של מדיה נוירובזאלית טרייה ולערבב בעדינות.
      הערה: אין לערבל את תערובת מגיב lipofection. שימוש בריאגנטים lipofection טריים יכול לשפר את יעילות transfection.
   3. לדגור על הצינורות במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
   4. הוסיפו את תערובת מגיב הליפופקציה טיפתית לתערובת הדנ"א, ערבבו בעדינות ודגרו במשך 20 דקות ב-RT.
   5. התאם את נפח המדיה בכל באר ל -1 מ"ל של מדיה מותנית.
   6. מוסיפים את מגיב lipofection -תערובת DNA טיפה לבאר.
   7. להחזיר תאים לאינקובטור ולאפשר לפחות 3-4 ימים לביטוי חלבון.
      הערה: למטרות פרוטוקולי ההפנמה והמחזור המתוארים להלן, נוירונים בהיפוקמפוס הודבקו ב-DIV11-12 עם מבנים המבטאים GluN2B מתויגים בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בתחום החוץ תאי (GFP-GluN2B) וצולמו ב-DIV15-16.
3. אופציונלי: דגירה של תאים עם תרופות (כרונית או חריפה) במדיה מותנית עד קיבוע.
   הערה: לטיפול אקוטי, יש להתחיל לטפל בתאים לפני התווית. בהתאם לפרוטוקול הטיפול התרופתי בו נעשה שימוש, תאים יכולים להישמר במדיה המכילה סמים במהלך סעיף 2. בדוגמה שלנו, תאי DIV21 היו כפופים לפרוטוקול הגברה לטווח ארוך (cLTP) המושרה כימית כדי להגביר את קולטן החומצה α-אמינו-3-הידרוקסי-5-מתיל-4-איזוקסזולפרופיוני (AMPAR).
   1. החלפת מדיה מותנית עבור פתרון חוץ-תאי (ECS).
   2. טפל בתאים עם גליצין של 300 מיקרומטר ב- ECS למשך 3 דקות ב- RT. כבקרה, יש לטפל בכיסוי אחות עם ECS (ללא גליצין).
   3. יש לשטוף תאים 3x עם ECS של 37°C ולהחזיר את התאים ב-ECS (ללא גליצין) לאינקובטור התא למשך 20 דקות לפני המשך סעיף 2.
      הערה: ECS (ב-mM): 150 NaCl, 2 CaCl₂, 5 KCl, 10 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 30 גלוקוז, 0.001 tetrodotoxin (TTX), 0.01 סטריכנין ו-0.03 picrotoxin ב-pH 7.4.

2. תיוג חי של קולטנים המבוטאים בפני השטח

1. הכנת כיסויים לתיוג
   1. כדי לחסוך ריאגנטים ולהקל על מניפולציה, העבר את צד התא המכסה עד למגש מכוסה בסרט פרפין.
      הערה: חשוב לא לתת לדגימות להתייבש.
   2. שמור ותחזק מדיה מותנית ב 37 ° C עבור שלבי הדגירה והכביסה.
      הערה: עבור כיסוי של 18 מ"מ, מומלץ לדגור עם 75-100 μL של מדיה לסימון נוגדנים ו 120-150 μL להפנמה/מיחזור.
2. תיוג קולטני פני השטח עם נוגדן ראשוני
   1. לדגור על תאים עם נוגדן ראשוני מדולל במדיה מותנית במשך 15 דקות ב RT.
      הערה: עבור קולטנים מתויגים GFP, נוגדן נגד GFP ארנב בדילול של 1:1000 שימש. עבור GluA1 אנדוגני, עכבר anti-GluA1 בדילול 1:200 שימש.
   2. יש לשאוף בזהירות מהמדיה המכילה נוגדנים באמצעות פיפטה ואקום ולשטוף תאים שלוש פעמים במדיה מותנית.
      הערה: אם מדיה מותנית אינה זמינה, ניתן לבצע את כל שלבי הכביסה באמצעות PBS+ [מלח חוצץ פוספט (PBS) המכיל 1 mM MgCl₂ ו- 0.1 mM CaCl₂]. שאיפה ידנית באמצעות מיקרופיפטה יכולה להתבצע אם שאיפת ואקום עדינה אינה זמינה.

3. ביטוי פני השטח (איור 1)

1. תיוג נוגדנים משני של קולטנים המתבטאים בפני השטח
   1. יש לכבס פעם אחת עם PBS+ .
   2. תקן תאים על ידי דגירה עם 4% פרפורמלדהיד (PFA) ו-4% סוכרוז ב-PBS למשך 7-8 דקות.
      הערה: בניגוד לשיטות קיבוע אחרות כגון דגירה מתנול, PFA אינו מחלחל לקרום הפלזמה ולכן מתאים לניתוח ביטוי פני השטח. לקבלת תוצאות מיטביות, יש להשתמש ב-PFA טרי. אחסון לטווח קצר של PFA ב 4 ° C או לטווח ארוך (עד 30 ימים) אחסון ב -20 ° C הוא מתירני עבור קיבוע נאות.
      זהירות: PFA הוא חומר מסרטן ידוע. יש להשתמש בציוד מגן אישי מתאים ובמכסה מנוע בטיחות בעת הטיפול.
   3. לשטוף תאים שלוש פעמים עם PBS.
      רגיל הערה: לחלופין, גליצין 0.1M יכול לשמש לשטיפת PFA במקום PBS, כמו גליצין יהיה להרוות כל קיבוע שנותר שעלול להגדיל את הרקע בתכשיר.
   4. חסום אתרי קשירה לא ספציפיים על ידי דגירה עם 10% סרום עיזים רגיל (NGS) ב- PBS למשך 30 דקות ב- RT.
      הערה: ניתן להאריך את זמן החסימה ללא השפעות שליליות על התווית.
   5. דגירה עם נוגדן משני מתויג פלואורסצנטי מדולל ב -3% NGS ב- PBS למשך שעה אחת ב- RT כדי לתייג קולטנים מסומנים בנוגדנים ראשוניים (כלומר, מבוטא פני שטח).
      הערה: בדוגמאות אלה נעשה שימוש בדילול של 1:500 של נוגדנים משניים מצומדים של Alexa 555: עז נגד ארנב עבור קולטנים המסומנים ב-GFP ואנטי-עכבר עיזים עבור GluA1.
   6. שטפו תאים עם PBS 3x.
2. תיוג קולטנים תוך תאיים
   1. חדיר תאים עם 0.25% Triton X-100 ב- PBS למשך 5-10 דקות ב- RT.
      הערה: כדי לבדוק שהסבב הראשוני של תיוג נוגדנים תופס את כל אפיטופי פני השטח, ניתן לדלג על שלב החדירות הזה בתרבית אחות. במקרה זה, אין לקבל אות עבור קולטנים תוך תאיים. בנוסף, כדי לבדוק שלא סומנו קולטנים פנימיים בסעיף 2 הקודם (כלומר, להראות את שלמות קרומי הפלזמה בתרבית), ניתן לדלג על שלב החדירות בתרבית אחות, וניתן להשתמש בנוגדן ראשוני כנגד חלבון תוך תאי (למשל, חלבון בצפיפות פוסט-סינפטית 95 [PSD-95] או חלבון הקשור למיקרוטובול 2 [MAP2]). אין לקבל אות מראשוני זה בתנאים אלה. במקרה זה, נוגדן ארנב נגד PSD-95 (1:500) שימש.
   2. חסום עם 10% NGS ב- PBS למשך 30 דקות ב- RT.
   3. תייגו קולטנים תוך-תאיים על ידי דגירה של תאים חדירתיים עם אותו נוגדן ראשוני המשמש בסעיף 2.2 מדולל ב-3% NGS ב-PBS למשך שעה אחת ב-RT.
      הערה: דילול הנוגדנים לתיוג קולטנים תוך-תאיים עשוי להיות שונה מזה הנדרש לתיוג קולטנים המבוטאים על פני השטח. בדוגמה של GluA1, נעשה שימוש באותו דילול נוגדנים (1:200).
   4. לשטוף תאים 3x עם PBS.
   5. תווית עם נוגדן משני שני מתויג פלואורסצנטי מדולל ב -3% NGS ב- PBS למשך שעה אחת ב- RT.
      הערה: בדוגמאות אלה, נעשה שימוש בדילול 1:500 של נוגדן משני מצומד נגד עכבר עז Alexa 647 (עבור GluA1).
   6. לשטוף תאים 3x עם PBS.

4. הפנמה (איור 2)

1. הפנמה של קולטני פני שטח מסומנים בנוגדנים
   1. לאחר תיוג קולטנים המתבטאים בפני השטח ושטיפת נוגדנים (סעיף 2.2), יש לשמור על התאים במדיה מותנית ללא נוגדנים ולהחזירם לאינקובטור (37°C) כדי לאפשר הפנמה.
      הערה: עבור קולטני N-methyl-D-aspartate (NMDA), מומלץ 30 דקות להפנמה. כבקרה, ניתן לשמור על תרבות אחות עם מדיה מותנית בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך תהליך ההפנמה. הפנמת קולטן מינימלית צריכה להתרחש בתנאים אלה.
2. תיוג קולטני פני השטח
   1. שטפו תאים פעם אחת באמצעות PBS+ .
   2. תקן תאים עם 4% PFA ו-4% סוכרוז ב-PBS למשך 7-8 דקות.
      זהירות: השתמש בציוד מגן אישי מתאים ובמכסה מנוע בטיחות בעת טיפול ב- PFA.
   3. לשטוף תאים 3x עם PBS רגיל.
   4. חסום עם 10% NGS ב- PBS למשך 30 דקות ב- RT כדי למנוע קשירה לא ספציפית.
   5. דגמו דגימות עם נוגדן משני מתויג פלואורסצנטי מדולל ב-3% NGS ב-PBS למשך שעה אחת ב-RT כדי לתייג קולטנים ראשוניים המסומנים בנוגדנים (כלומר, קולטנים המבוטאים בפני השטח שלא הופנמו).
      הערה: בדוגמה זו, Alexa 555-conjugated goat goat anti-rabbit secondary anti-rabbit anti-rabbit anti-rabbit (1:500) שימש לתיוג.
   6. לשטוף תאים 3x עם PBS.
3. תיוג קולטנים מופנמים
   1. חדיר תאים עם 0.25% Triton X-100 ב- PBS למשך 5-10 דקות.
   2. חסום קשירה לא ספציפית על ידי דגירה עם 10% NGS ב- PBS למשך 30 דקות ב- RT.
   3. דגימות דגירה עם נוגדן משני מתויג פלואורסצנטית מדולל ב -3% NGS ב- PBS למשך שעה אחת ב- RT כדי לתייג קולטנים מופנמים המסומנים בנוגדנים.
      הערה: עבור דוגמה זו, Alexa 647-conjugated goat goat anti-rabbit antibody) משמש לתיוג.
   4. לשטוף תאים 3x עם PBS.

5. מיחזור (איור 3)

1. הפנמה של קולטני פני שטח מסומנים בנוגדנים
   1. לאחר תיוג קולטנים המתבטאים בפני השטח ושטיפת נוגדנים (סעיף 2.2), יש לשמור על התאים במדיה מותנית ללא נוגדנים ולהחזירם לאינקובטור (37°C) כדי לאפשר הפנמה.
      הערה: עבור קולטני NMDA, מומלץ 30 דקות להפנמה.
2. חסימת קולטנים מבוטא של משטח יציב
   1. כדי לחסום את האפיטופים על הנוגדן הראשוני המחובר לקולטנים המבוטאים על פני השטח שלא הופנמו, דגרו על תאים עם מקטעי נוגדנים Fab anti-IgG (H+L) לא מצומדים (כנגד הראשוני המשמש בסעיף 2.2) מדוללים במדיה מותנית (20 מיקרוגרם / מ"ל) למשך 20 דקות ב- RT. טיפול זה מונע אינטראקציה עתידית עם נוגדנים משניים.
      הערה: עבור דוגמה זו, נעשה שימוש בשברי Fab נגד ארנבים עזים.
      הערה: ניסוי בקרה: כדי להבטיח שהתרחשה חסימה מוחלטת של קולטנים המבוטאים על פני השטח, ניתן לדגור על כיסויי אחות עם ובלי Fab. יש לתקן תרביות מיד לאחר הטיפול בפאב, ושתי התרביות מודגרות עם נוגדן משני מצומד אלקסה 555. אין אות Alexa 555 בתאים המודגרים על Fab המעיד על חסימת נוגדנים תקינה.
   2. לשטוף תאים 3x עם מדיה ממוזגת.
   3. לדגור על תאים עם מדיה מותנית המכילה דינזור 80 מיקרומטר כדי למנוע הפנמה נוספת ולהחזיר תאים לאינקובטור (37 מעלות צלזיוס) כדי לאפשר מחזור של קולטנים מופנמים. Dynasore הוא מעכב GTPase המעכב דינמין ולכן מונע הפנמה.
      הערה: מומלץ מיחזור NMDAR למשך 45 דקות. שימו לב ש-Dynasore חוסמת באופן בלעדי את תהליך ההפנמה התלוי בדינמין (למשל, הפנמת NMDAR). עם זאת, הפנמה של חלבון סינפטי אחר (שאינו תלוי בדינמין) עדיין יכולה להתרחש בנוכחות Dynasore.
3. תיוג קולטנים ממוחזרים
   1. שטפו תאים פעם אחת באמצעות PBS+ .
   2. תקן תאים עם 4% PFA ו-4% סוכרוז ב-PBS למשך 7-8 דקות.
      זהירות: השתמש בציוד מגן אישי מתאים ובמכסה מנוע בטיחות בעת טיפול ב- PFA.
   3. לשטוף תאים 3x עם PBS.
   4. חסום עם 10% NGS ב- PBS למשך 30 דקות ב- RT כדי למנוע קשירה לא ספציפית.
   5. תאי תווית עם נוגדן משני מתויג פלואורסצנטי ראשון מדולל ב-3% NGS ב-PBS למשך שעה אחת ב-RT.
      הערה: בדוגמה זו, Alexa 555-conjugated goat goat anti-rabbit anti-rabbit anti-rabbit (1:500) שימש לתיוג.
   6. לשטוף תאים 3x עם PBS.
      הערה: שטיפות ארוכות יותר עם PBS (5-10 דקות) עשויות לעזור להפחית את הרקע בהכנה.
4. תיוג קולטנים מופנמים
   1. חדיר תאים עם 0.25% Triton X-100 ב- PBS למשך 5-10 דקות.
   2. חסום עם 10% NGS ב- PBS למשך 30 דקות ב- RT.
   3. תווית עם נוגדן משני שני מתויג פלואורסצנטי מדולל ב -3% NGS ב- PBS למשך שעה אחת ב- RT.
      הערה: בדוגמה זו, Alexa 647-conjugated goat goat anti-rabbit anti-rabbit (1:500) שימש לתיוג.
   4. לשטוף תאים 3x עם PBS.

6. הרכבה והדמיה של דגימות

1. הרכבה של תאים על ידי הנחת צד התא המכסה כלפי מטה על 12-15 μL של מדיית ההרכבה המתאימה.
   הערה: שאיפה של מדיה הרכבה עודף ישפר את איכות התמונות.
2. תאי תמונה במיקרוסקופ קונפוקלי מתאים.
   הערה: מומלץ לצלם מחסנית z בהגדלה של 60x עם צעדים של 0.35 מיקרומטר, המקיפים את כל עובי תא העצב.

7. שיקולי זמן

1. זהו פרוטוקול ארוך שניתן לעצור בכמה נקודות. אם תרצה, בצע חסימה ושלבי דגירה ראשוניים של נוגדנים למשך הלילה ב -4 מעלות צלזיוס בתא לח.
2. לחלופין, אם תרצה, השתמש במעבד רקמת מיקרוגל כדי להאיץ באופן משמעותי את זמני הדגירה שלאחר הקיבוע. עבור כל השלבים, השתמש ב- 150 ואט ב- 30 ° C עבור הגדרות "מופעל".​
   1. כדי לחסום, הפעל את המעבד ב- 2 דקות "מופעל", 1 דקות "כבוי" ו- 2 דקות "מופעל".
   2. לשלבי דגירה ראשוניים ומשניים של נוגדנים, הפעל את המעבד ב- 3 דקות "מופעל", 2 דקות "כבוי" ו- 3 דקות "מופעל."
      הערה: אנו לא רואים הבדל באיכות על ידי ביצוע השינויים לעיל בפרוטוקול.

8. ניתוח תמונות

1. מומלץ להשתמש ב- FIJI לביצוע ניתוח תמונות, מכיוון שהוא תואם לפורמטים מרובים של קבצים. עבור הנתונים שלנו, נרכשו תמונות בתבנית הקובץ Nikon ND2.
2. סקריפט מאקרו מסופק לכימות אצווה קל של פרמטרים שונים שנבחרו מראש על ידי FIJI. השלבים הבאים כלולים במאקרו:
   הערה: עבור דוגמאות אלה נמדדה "עוצמה משולבת".
3. פתח את קבצי התמונה בפיג'י ובערוצים נפרדים.
4. Z-הקרן כל ערימת ערוצים כהקרנה בעוצמה מרבית.
5. הגדר סף נמוך יותר עבור כל ערוץ.
   הערה: ערכי סף צריכים להיקבע אמפירית עבור כל ערכת נתונים ניסיונית. בעוד שלכל ערוץ יכול להיות ערך סף נמוך נפרד, חיוני שערכי סף הערוץ יישמרו באופן עקבי לכל התמונות של אותה ערכת נתונים.
6. בחר שלושה עד חמישה דנדריטים משניים או שלישוניים ושמור אותם כאזורי עניין (ROIs).
7. מדוד את הצפיפות המשולבת של כל החזר השקעה בערוצים משטחים ותוך תאיים.
8. נרמל את האות עבור כל החזר השקעה על ידי חלוקת ערך הצפיפות המשולב של ערוץ פני השטח בערוץ התוך תאי.
9. חזור על המדידות עבור כל תמונות הבקרה והניסוי ונרמל ערכי ניסוי כדי לשלוט בערכים (לדוגמה, GluN2B WT או תנאים ללא גליצין).

תוצאות

איור 1: cLTP מגביר את ביטוי פני השטח של GluA1. נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס ב-DIV21 היו נתונים לכימיקל LTP (cLTP) על ידי דגירה עם ECS המכיל גליצין. תיוג ברור של אוכלוסיות GluA1 המבוטאות על פני השטח (אדום) לעומת תוך-תאי (כחול) חושף את הגידול הצפוי בביטוי פני השטח של AMPAR. (A) מישור יחיד ו-(B) Z-stacked (הקרנה בעוצמה מרבית) תמונות קונפוקליות. פסי קנה מידה = 50 מיקרומט...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קוטר 18 מ"מ. #1.5 כוסות כיסוי עבות	נויבטרו	GG181.5
Alexa 555-conjugated עז נגד עכבר משני	לייף טכנולוגיות	A21424
אלקסה 555-עז מצומדת נגד ארנב משני	לייף טכנולוגיות	A21429
Alexa 647-conjugated עז נגד עכבר משני	לייף טכנולוגיות	A21236
Alexa 647-conjugated עז נגד ארנב משני	לייף טכנולוגיות	A21245
B27	גיבקו	17504044
CaCl2	סיגמא	C7902
צלחות תרבית תאים תחתונות שטוחות של Corning Costar	קורנינג	3513
דינסור	טוקריס	2897
גלוקוז	סיגמא	G8270
גליצין	טוקריס	219
עז נגד ארנב שברי פאב	סיגמא	SAB3700970
HEPES	סיגמא	H7006
KCl	סיגמא	עמ' 9541
ל-גלוטמין	סיגמא	G7513
ליפופקטמין 2000	Invitrogen	11668019
עכבר נוגדן נגד GluA1	מיליפור	MAB2263
NaCl	סיגמא	S6546
מדיה נוירובזלית	גיבקו	21103049
NGS	אבקאם	אפרת 7481
פארפילם	במיס	PM999
PBS	גיבקו	10010023
פלקו ביו-ווייב	טד פלה	36500
פיפ"א	אלפא עזר	43368
פיקרוטוקסין	טוקריס	1128
פולי-D-ליזין הידרוברומיד	סיגמא	P7280
ProLong זהב Antifade mountant	לייף טכנולוגיות	P36934
נוגדן ארנב נגד GFP	Invitrogen	A11122
נוגדן ארנב נגד PSD-95	איתות סלולרי	2507
סטריכנין	טוקריס	2785
סוכרוז	סיגמא	S0389
Superfrost פלוס שקופיות מיקרוסקופ	פישר	12-550-15
טריטון X-100	סיגמא	X100
TTX	טוקריס	1078