כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. הכנת מיקרוספירת מטרה
- בחר אנטיגן יעד רלוונטי.
הערה: בדוגמה זו, נעשה שימוש בחלבון הרקומביננטי V1V2-2F5K, שנועד לחקות את הקודקוד הטרימרי של מעטפת HIV מקורית.
- ביצוע ביוטינילציה באמצעות ערכה מסחרית (Table of Materials) בהתאם לפרוטוקול היצרן.
- חשב mmol של מגיב ביוטין כדי להוסיף לתגובה עבור עודף מולארי פי 5 באמצעות הנוסחה: mmol biotin = mL חלבון x (חלבון מ"ג / חלבון מ"ל) x (mmol ביוטין / מ"ג חלבון) x (5 mmol ביוטין / mmol חלבון). לאחר מכן חשב μL של מגיב ביוטין להוסיף באמצעות הנוסחה: μL ביוטין = mmol biotin x (1,000,000 μL / L) x (L/10 mmol ).
- יש לאזן את הביוטין לטמפרטורת החדר לפני הפתיחה. להמיס חלבון ב 0.5-2.0 מ"ל של מלוחים חוצצים פוספט (PBS) על פי החישוב שנעשה לעיל.
- הכינו תמיסה של 10 מילימטר של מגיב ביוטין בדימתיל-סולפוקסיד (DMSO) והוסיפו את הנפח המתאים של מגיב ביוטין 10 מילימ"ר לתמיסת החלבון, ודגרו תגובה על קרח במשך שעתיים או בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- הסר עודפי ביוטין באמצעות רכזי חלבונים (ממברנות פוליאתרסולפון [PES], חיתוך משקל מולקולרי של 3 kDa [MWCO], 0.5 מ"ל; טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן.
- הפקד דגימה לתוך החדר העליון של עמוד הספין והוסף PBS עד 400 μL. מכסה, ולאחר מכן הכנס תא דגימה זה לתוך צינור איסוף. צנטריפוגה במהירות 12,000 x גרם בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- יש להשליך את הזרימה ולהוסיף PBS ל-400 μL. צנטריפוגה חוזרת. יש להשליך את הזרימה ולהוסיף PBS ל-100 μL. למדוד את ריכוז החלבון באמצעות ספקטרופוטומטר.
הערה: ניתן לאטום ולהקפיא חלבון בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.
2. הכנת צלחת בדיקת פגוציטוזה תאית תלוית נוגדנים (ADCP)
- הצמידו חלבון ביוטינילציה למיקרוספרות של 1 מיקרומטר ('חרוזים'; טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן.
- לכל צלחת של חרוזים מצומדים, יש לדגור על 6 מיקרוגרם חלבון עם 12 מיקרוליטר של חרוזי ציר ב-200 מיקרוליטר של אלבומין בסרום בקר 0.1% (BSA)-PBS בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, תוך ערבול עדין כל 20 דקות.
- צנטריפוגה ברזולוציה של 13,000 x גרם למשך 5 דקות. יש להשליך את הסופר-נטנט, לערבל בעדינות ולהשהות מחדש ב-1200 מיקרוליטר של 0.1% BSA-PBS. חזור על הסחיטה והכביסה שלב 2x. השהיה מחדש ב-1200 מיקרוליטר של 0.1% BSA-PBS.
- Aliquot 10 μL של תמיסת חרוזים לכל באר בצלחת תחתונה עגולה 96 באר. הכינו דילולים של נוגדנים או סרה חיסונית בעלי עניין ב-12 מיקרוליטר של 2% HSA HBSS, בדרך כלל החל מ-50 מיקרוגרם/מ"ל של נוגדנים או דילול של 1/100 בסרום.
הערה: בנתוני הדגימה נעשה שימוש בנוגדן חד שבטי (mAb) 830A.
- הוסף 10 μL של נוגדן/סרה טיטראט לצלחת החרוזים ודגר במשך שעתיים ב 37 ° C. הוסף 200 μL של 2% HSA HBSS לכל באר וצלחת צנטריפוגה ב 2,000 x גרם למשך 10 דקות.
- הסר בזהירות את הסופרנאטנט על ידי התהפכות מהירה וניקוז של נוזלים מבארות הצלחת לתוך כיור כדי למנוע הפרעה לגלולת החרוזים הבלתי נראית.
3. בידוד תאי חלב אם
- להשיג חלב אם אנושי מנשים מניקות בריאות, המתבטא באמצעות משאבות אלקטרוניות או ידניות כפולות. בודד תאים בתוך ~ 4 שעות של ביטוי, שמירה על חלב בטמפרטורת החדר.
- באמצעות צינורות 50 מ"ל, צנטריפוגה 50 מ"ל חלב ב 800 x גרם במשך 15 דקות. בזהירות לשפוך את חלב רזה ושומן תוך השארת כדור התא ללא הפרעה. נגבו את החלק הפנימי של הצינור עם מגבון ללא סיבים כדי להסיר את כל השומן מדופן הצינור.
- הוסיפו 10 מ"ל של 2% אלבומן בסרום אנושי בתמיסת המלח המאוזנת של האנק (2% HSA HBSS [ללא Ca2+ או Mg+]). השהה מחדש את הגלולה על ידי פיפטינג עדין כדי למנוע הפעלת תאים ואפופטוזיס. מעבירים לצינור 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 450 x גרם למשך 10 דקות.
- יוצקים את supernatant ולחזור על שלב 1.3. לאחר מכן, השהה מחדש בעדינות תאים ב-1-2 מ"ל של 2% HSA HBSS בהתאם למספר התאים הצפוי, וספור תאים לפי המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי, תוך ציון כדאיות התא.
4. בדיקת ADCP
הערה: השיטות המתוארות כאן מותאמות מאקרמן ואחרים.
- הוסף 50,000 תאי BM מבודדים טריים לכל צלחת בדיקת ADCP היטב ב- 200 μL של 2% HSA-HBSS. לדגור במשך 2 שעות ב 37 ° C.
- עבור ניסויי בקרה, תאי קדם-דגירה בטמפרטורה של 37°C עם מעכב אקטין של 10 מיקרוגרם/מ"ל (ציטוכלסין-D), חומר חוסם קולטן Fc של 50 מיקרוגרם/מ"ל (FcBlock), או שילוב של שניהם לפני הוספתם ללוחות.
- צלחת צנטריפוגה ב 930 x גרם למשך 10 דקות. הוסף 200 μL של 2% HSA HBSS וצנטריפוגה חוזרת. בזהירות להסיר supernatant כמו בשלב 2.7 ולחזור על שטיפה.
- יש להסיר בזהירות את תאי העל והכתמים לכדאיות באמצעות כתם כדאיות של 0.5 מיקרוגרם/מ"ל (ריכוז סופי) הניתן לקיבוע 450 לבאר ב-50 מיקרוליטר של 2% HSA HBSS. יש לדגור 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. צלחת צנטריפוגה ב 930 x גרם במשך 10 דקות ולהסיר supernatant כמו בשלב 2.7. הוסף 200 μL של 2% HSA HBSS וצלחת צנטריפוגה שוב ולאחר מכן הסרת supernatant כמו בשלב 2.7.
- לאחר צביעת כדאיות, תאי צביעה עבור סמנים לויקוציטים מעניינים, כולל מינימום כולל כתם ספציפי CD45 כגון PE-עכבר CD45 אנטי אנושי (שיבוט HI30) בריכוז אופטימלי (1 מיקרוגרם / μL ב 50 μL של 1% BSA HBSS בנתונים לדוגמה).
הערה: ניתן לכלול כל סמני עניין ספציפיים לשושלת.
- יש לדגור 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. צלחת צנטריפוגה ב 930 x גרם במשך 10 דקות ולהסיר supernatant כמו בשלב 2.7. הוסף 200 μL של 1% BSA HBSS וצנטריפוגה חוזרת. הסר supernatant. תקן תאים ב 200 μL של 0.5% פורמלדהיד בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות או לילה ב 4 ° C. מקררים בחושך עד לניתוח.
5. אנליזה לפי ציטומטריית זרימה
- בצעו gating ראשוני כדי לסלק כפילויות בתרשים פיזור קדמי (FSC) לעומת פיזור צדדי (SSC) ופסולת (חומר קטן מ-FSC = 5000) (ראו איור 1). השתמש בתרשים SSC לעומת כתם כדאיות (V450 במקרה זה) כדי לחסל תאים מתים (אלה חיוביים לכתם כדאיות).
- השתמש בתרשים SSC לעומת CD45 כדי להבדיל בין מחלקות הלויקוציטים העיקריות (גרנולוציטים, מונוציטים, לימפוציטים) כמתואר בהרחבה.
הערה: סיווג זה הוא רק סוגסטיבי ויש צורך בסמנים ספציפיים לשושלת כדי לאשר את סוג התא.
- עבור כל תאי CD45+, או עבור כל תת-קבוצה של לויקוציטים, למדוד את פעילות ADCP על ידי gating עם סמן על התאים חיוביים חרוזים בהיסטוגרמה של ערוץ איזותיוציאנט פלואורסצאין (FITC), שבו חרוזים פלואורסצנטיים מזוהים.
הערה: בארות הבקרה השליליות שבהן לא נוספו חרוזים יצביעו היכן נראים התאים החיוביים לחרוזים בהיסטוגרמה ולכן היכן למקם את סמן הגאט.
- חשב ציוני ADCP כ- (עוצמת הפלואורסצנטיות החציונית [MFI] של תאים חיוביים לחרוזים) x (% מכלל תאי CD45 + באוכלוסייה החיובית). השתמש בתוכנה גרפית כדי להתוות ציונים בכל ריכוז Ab/serum ולבצע ניתוח אזור מתחת לעקומה (AUC).
הערה: ADCP נחשב חיובי אם AUC גדול מ 3x סטיית תקן של ציון ADCP AUC של mAb בקרה שלילית לא ספציפית (במקרה זה, 3865).
