כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת תאי חיסון מטחול העכבר
הערה: המתת חסד של עכברים תמימים באמצעות המתת חסד של פחמן דו חמצני (CO2). עכברי C57BL/6 שנרכשו ממעבדות ג'קסון וגודלו בבית משמשים לניסויים בגיל 6-12 שבועות. עכברים זכרים ונקבות כאחד משמשים לניסויים.
- יש לחטא את עור העכבר באתנול 70% על מנת לצמצם את האפשרות של מזהמים חיצוניים להיכנס לדגימה.
- נתחו את טחול העכבר באמצעות כלי דיסקציה, מספריים כירורגיים ומלקחיים. קצרו את הטחול והניחו את הטחול המנותק לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל עם ~ 5 מ"ל של מדיה שלמה של מכון הזיכרון רוזוול פארק (cRPMI) על קרח.
הערה: RPMI מלא מורכב מ-10% נסיוב בקר עוברי (FBS), 2 מילימ"ר L-גלוטמין ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין.
- כדי לקצור את טחול העכבר, בצע חתך של 5 ס"מ לתוך הפרווה והעור לאורך הצד השמאלי של העכבר באמצע הדרך בין הרגליים הקדמיות והאחוריות עם מספריים. פתח את חלל הגוף ~ 5 ס"מ והסר את הטחול באמצעות מלקחיים. הטחול הוא בצבע של שעועית כליה והוא ארוך ושטוח יותר מהכליה השכנה.
- שפכו את התוכן של שלב 1.2 על מסנן סטרילי של 70 מיקרומטר המחובר לצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל. מפרידים מכנית את הטחול לתרחיף חד תאי על ידי דחיפת הטחול דרך הפילטר עם בוכנה מזרק 5 מ"ל עד שלא נשאר עיסת טחול על משטח המסנן.
- גלול את הטחול באמצעות צנטריפוגת רוטור מתנדנדת החוצה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- בזהירות decant supernatant. הטחול הכדורי נשאר בתחתית הצינור החרוטי 50 מ"ל.
- כדי להסיר תאי דם אדומים, יש להשעות מחדש את הטחול הכדורי ב-1 מ"ל של חיץ ליזה אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK) למשך 3 דקות בהתאם להוראות היצרן. מערבבים היטב.
- להרוות את מאגר הליזיס ACK עם 15 מ"ל של cRPMI.
- גלולה הלימפוציטים לפי ההוראות בשלב 1.4.
- להשעות מחדש את השעיית התא ב 5 מ"ל של cRPMI בצינור חרוטי 50 מ"ל. מניחים את הדגימות על קרח.
- כדי לספור את התאים, העבירו 10 μL של תרחיף התא לצינור מיקרוצנטריפוגה של 0.6 מ"ל ודללו ביחס של 1:1 עם תמיסה כחולה טריפאן. לאחר מכן, העבר להמוציטומטר או למערכת ספירת תאים אוטומטית.
- לאחר הספירה, בהתאם לריכוז התא בתרחיף התא כמו בשלב 1.9, יש להכניס את התאים לצנטריפוגה שולחנית בטמפרטורה של 500 x גרם ב-4°C למשך 5 דקות כדי להתכונן לתוספת של מדיית cRMPI המכילה צבע אסטר Indo-1 AM.
- חשב את נפח ההשעיה מחדש של התאים כדי להשיג 10-12 x 106 תאים / מ"ל. זהו ריכוז של פי 2 מספירת התאים הכוללת הנדרשת.
- השעה מחדש את התאים בנפח cRPMI המחושב בשלב 1.11. מקם את התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 בצינור חרוטי 50 מ"ל עם מכסה מאוורר או צלחת תרבית רקמה.
2. צבע יחסי הודו-1 ותיוג נוגדנים פלואורסצנטיים
- בהתאם להוראות היצרן, הוסף 50 μL של dimethyl sulfoxide (DMSO) לתוך בקבוקון המכיל 50 מיקרוגרם של Indo-1 AM. ריכוז תמיסת המניות הוא 1 מיקרוגרם/μL.
הערה: DMSO מסופק במיקרו-בקבוקונים עם הערכה למניעת חמצון של DMSO.
- לדלל את aliquot מלאי (1 מיקרוגרם / μL) לתוך נפח הניסוי המתאים (נקבע ב 1.11) של cRPMI בריכוז של 6 מיקרוגרם / מ"ל, ריכוז 2x. אין לאחסן Indo-1 בתמיסה מימית.
הערה: ניתן להשתמש במאגרים אחרים עם תוספת סידן בהתאם לצרכי התא.
- הניחו את המדיה המלאה עם Indo-1 בצד באמבט מים בטמפרטורה של 37°C.
הערה: השתמש בריכוז המינימלי של אסטר Indo-1 AM הדרוש כדי לקבל אות הולם. זה צריך להיות titrated עבור סוגי תאים שונים. בדרך כלל, ריכוז בין 3-5 מיקרומטר מספיק. עבור תאי T ראשוניים, טעינת תאים עם Indo-1 בריכוז >5 מיקרוגרם/מ"ל מגדילה את העוצמה הפלואורסצנטית הממוצעת (MFI) מעל לוג של 6 על ציטומטרים של זרימה ספקטרלית. במקרה כזה, הפחיתו את עוצמת הלייזר האולטרה סגול (UV) וטיטרטו את ה-Indo-1 לריכוז נמוך יותר.
- לדלל את מתלי התא שהוכנו מראש (בשלב 1.12), 1:1 ב-cRPMI, כולל מדיית 2x Indo-1 שיוצרה בשלב 2.2. ודא כי התאים נמצאים בריכוז בין 5-6 x 106/mL.
הערה: אין לצבוע, לטעון בקרת כתמים בודדים לא מוכתמים או סמן פני שטח פקדי תא כתם יחיד עם Indo-1. הוספת Indo-1 לבקרות נוגדנים עם כתם יחיד תיצור דגימה מרובת צבעים עקב הוספת Indo-1 לתאים מוכתמים בודדים. כלול indo-1 (ללא סידן), אתילן גליקול, חומצה טטראצטית (EGTA) תוספת בקרה ללוח הדגימה שנוצר בשלב 2.6.
- הוסף 1 מ"ל של תאים/באר/מצב ניסיוני לצלחת תרבית רקמה של 12 בארות.
- צור בקרה מוכתמת יחידה עבור דגימת Indo-1 (ללא סידן) באמצעות תאים שהיו טעונים בעבר בצבע Indo-1 והוסף EGTA לריכוז סופי של 2 mM. EGTA תצבית סידן בתרחיף התא, ותעניק דגימת בקרה נקייה יותר.
- צור בקרה חיובית של Indo-1 (קשורה לסידן Indo-1) על ידי הוספת 50 מיקרומטר של יונומיצין לתרחיף התאים הטעון בצבע בציטומטר הזרימה. יונומיצין הוא יונופור סידן חדיר לממברנה הקושר יוני סידן ומקל על העברת יוני סידן לתאים.
- צור באר להדברה שלילית ביולוגית ללא פלואורופורים או צבע הודו-1.
- צור באר לבקרות כתמים בודדים עבור כל אוכלוסיות תאים נוספות המעניינות (נוגדנים מוגדרים על-ידי המשתמש) באמצעות פלואורופורים מצומדים של נוגדנים בעיצוב לוח ציטומטריה של זרימה. אלה לא יכללו את הצבע היחסי הודו-1.
- הוסף את הנוגדן חוסם קולטן Fc (~ 2 מיקרוגרם / 1 x 106 תאים), בהתאם להוראות היצרן, לפני הוספת נוגדנים מצומדים פלואורוכרום נוספים לצביעת פני השטח.
- לדגור על הצלחת במשך 45 דקות ב 37 ° C עם 5% CO2.
- השהה מחדש את התאים בצלחת של 12 בארות על ידי הקשה עדינה על הצלחת כל 15 דקות.
- מערבבים ומסירים את כל נפח התאים התלויים במדיה מהצלחת בת 12 הקידוחים. לאחר מכן הוסף את השעיית התא לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.7 מ"ל.
- מכניסים את התאים למיקרוצנטריפוגה במהירות של 500XG למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. דקרו את הסופרנאטנט ושטפו את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של cRPMI שחומם מראש. גלולה שוב ודקנט את הסופרנטנט.
הערה: שטיפת התאים מסירה את כל הנוגדנים חוסמי Fc שנותרו.
- להשהות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של cRPMI בצינורות מיקרוצנטריפוגות 1.7 מ"ל ולדגור על כל צינור ב 37 ° C במשך 30 דקות נוספות ב 5% CO2, משאיר את החלק העליון של הצינור פתוח מעט כדי לאפשר חילופי גז. זה מאפשר דה-אסטריפיקציה מלאה של אסטרי AM תוך תאיים.
- מעבירים את התאים חזרה לצלחת תרבית רקמה בת 12 בארות, במידת הצורך. ניתן להוסיף נוגדנים מצומדים נוספים המוגדרים על ידי המשתמש בשלב מנוחה.
הערה: סמנים המשמשים בחלונית השיטות כוללים: Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 ו- CD1d/α-galcer tetramer. סמנים נבחרים לנתח תת-קבוצות של תאי T.
- צור תערובת אב של כל הנוגדנים המצומדים פלואורוכרום המוגדרים על-ידי המשתמש בהתאם לסוגי התאים המעניינים בנפח טיטרטיבי קודם לכן לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.7 מ"ל.
- הוסף תערובת אב מחושבת עבור 1 מ"ל מנפח התא, בהתאם לנוגדנים טיטרטים לתאים נחים.
הערה: היתרון של צביעה בשלב 2.15 במקום בשלב 2.18 מאוחר יותר הוא שהכתמה בשלב 2.15 תקצר את זמן הדגירה הכולל של הניסוי. עם זאת, צביעה בנפח כולל של 1 מ"ל בשלב 2.15 מגבירה את השימוש בנוגדנים.
- לאחר מנוחה, גלולה את התאים ב 500 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: תאים בצלחת תרבית רקמה של 12 בארות יכולים להיות מכופפים בצלחת עם אביזר צנטריפוגה צלחת. אחרת, גלולה את התאים בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 מ"ל.
- לשטוף את התאים על ידי השעיה מחדש של הגלולה ב 1 מ"ל של 4 ° C cRPMI קר גלולה את התאים שוב כמו בשלב 2.16. מניחים את התאים על קרח.
הערה: אם מכתימים תאים על פני השטח בנפרד, לאחר דה-אסטריפיקציה בשלב 2.18, יש צורך בפחות נפח נוגדנים. צביעת פני השטח בשלב זה יכולה להתבצע לאחר שלב המנוחה במאגר זרימה קרה (1x Dulbecco's phosphate-buffered saltered salter (DPBS) בתוספת 1% FBS), באמצעות נוגדנים המוגדרים על-ידי המשתמש, על קרח למשך 30 דקות. שטפו את התאים לאחר הכתם ב-cRPMI כמו בשלב 2.17.
- הוסף כתם כדאיות Ghost540 מדולל 1:7,500 ב- DPBS לדגימות בהתאם להוראות היצרן. חום הורג את התאים ב 55 ° C על בלוק התחממות עבור שליטה חיה / מת מוכתם יחיד.
הערה: צביעת צבע פונקציונלית כדאיות לסילוק תאים מתים בניתוח ציטומטרי זרימה מבוצעת ללא FBS. FBS יכול לקיים אינטראקציה עם צבעי אמין בהתאם להוראות היצרן.
- יש להשהות מחדש דגימות בודדות ב-500 מיקרוליטר של cRPMI (נטול פנול אדום) באמצעות צינור זרימת פוליסטירן 5 מ"ל עם מכסה.
הערה: תאים ניתן להשאיר ב 4 ° C עד שעה.
- יש לחמם כל צינור של 5 מ"ל המכיל תאים, בנפרד, לטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמצעות אמבט חרוזים במשך 7 דקות לפני הניתוח של ציטומטר הזרימה, תוך שמירה על זמן עקבי בין הדגימות. השתמש בטיימר.
3. צינור אמבט חרוזים: שמירה על טמפרטורה במהלך ניתוח שטף סידן
- הוסף חרוזי אמבטיה לאמבט מים קטן ללא תוספת מים; לחמם עד 37 מעלות צלזיוס.
- בזהירות לחתוך צינור חרוטי 50 מ"ל לשניים, בסימן 25 מ"ל, עם סכין גילוח; להשליך את החלק העליון של הצינור.
- ממלאים את הצינור החצוי 3/4 מהדרך בחרוזי אמבטיה.
- הכניסו את הצינור שנוצר בשלב 3.2 לאמבט החרוזים שנוצר בשלב 3.1. מביאים את הצינור והחרוזים ל 37 מעלות צלזיוס.
- חברו את אמבט החרוזים לשקע חשמל ליד ציטומטר הזרימה על מנת לשמור על הטמפרטורה לקראת ניתוח הדגימה.
- הוסף מתלה קלקר חרוטי בנפח 50 מ"ל חתוך כדי אחיזת צינור אחד כדי למקם את הצינור במקומו בזמן שהוא פועל על ציטומטר הזרימה. זה יבטל את הצורך להחזיק ידנית את הצינור למשך ניתוח העקומה.
