בדיקה לכימות הקשר של VLPs נורו-וירוס אנושי לחיידקי מעיים

תקציר

מקור: Madrigal, J. L., et al. כימות חלקיקים דמויי וירוס נורו-וירוס אנושי הנקשרים לחיידקים קומנסליים באמצעות ציטומטריית זרימה. J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מדגים בדיקה לכימות חלקיקים דמויי וירוס נורו-וירוס אנושי (VLPs) הנקשרים לחיידקי מעיים אנושיים. התרחיפים החיידקיים מעורבבים עם ה-VLPs ומודגרים כדי לאפשר היווצרות קומפלקסים של חיידקי VLP. לאחר מכן מסומנים הקומפלקסים בנוגדנים ספציפיים ל-VLP המתויגים כפלואורופורים, ולאחר מכן הדמיה וכימות מבוססי ציטומטריית זרימה כדי לזהות את אחוז החיידקים הקשורים ל-VLP.

פרוטוקול

1. בדיקת התקשרות חיידקי VLP

זהירות: נורו-וירוס אנושי VLPs מהווים סיכון ברמת בטיחות ביולוגית (BSL)-2, וכל העבודה הכרוכה ב-VLPs צריכה להתבצע בארון בטיחות ביולוגית. הכנת תרביות החיידקים לפני בדיקת ההתקשרות צריכה להתבצע בתנאי בטיחות המתאימים לאורגניזם.

1. הכנת מגיב
   1. 1x מלח חוצץ פוספט (PBS)
      1. הכינו 1 ליטר של 10x PBS על ידי המסת שקיק ב-1 ליטר מים שעברו דה-יוניזציה (DI).
      2. פתרון Autoclave למשך 30 דקות.
      3. הכינו תמיסה 1x על ידי דילול התמיסה הנ"ל ביחס 1:10 במי DI.
      4. מסננים לעקר את התמיסה על ידי העברתה דרך מסנן 0.22 מיקרומטר ואחסונם בטמפרטורת החדר.
   2. 5% BSA
      1. הוסף 5 גרם של אבקת אלבומין בסרום בקר (BSA) ל 100 מ"ל של PBS כדי ליצור תמיסת 5% (w/v).
      2. מערבבים את התמיסה על ידי ערבול או באמצעות מוט ערבוב מתכתי על צלחת ערבוב עד שהגושים נמסים.
      3. יש לעקר את המסנן באמצעות מסנן של 0.22 מיקרומטר.
      4. אחסנו את התמיסה בטמפרטורה של 4°C.
   3. חיץ כתמים ציטומטריה זרימה (FCSB)
      1. מסנן FCSB שנרכש (ראה טבלת חומרים) דרך מסנן 0.22 מיקרומטר.
      2. אחסנו את התמיסה הנותרת בטמפרטורה של 4°C.
   4. מאגר חסימה 5% (BB)
      הערה: הכינו טרי בכל פעם.
      1. הוסף 0.5 גרם של BSA ל 10 מ"ל של FCSB סטרילי.
      2. מערבלים היטב את הדגימה ומשאירים על קרח עד לשימוש.
2. צימוד נוגדנים
   1. הצמידו נוגדן GII של נורו-וירוס אנושי (ראו טבלת חומרים) עם r-פיקואריתרין (PE) באמצעות ערכת תיוג נוגדנים R-PE בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים).
   2. אחסן את הנוגדן המצומד בחושך ב -4 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי בניתוח בדיקת התקשרות חיידק VLP.
      הערה: הנוגדן הראשוני צריך להיות טיטרציה לפני השימוש בבדיקת ההתקשרות של חיידקי VLP כדי לקבוע את הריכוז הנכון הדרוש לניתוח ציטומטריית זרימה. יש לבצע טיטרציה של נוגדנים בכל פעם שתגובת הצמידות מבוצעת ועבור כל חיידק המשמש בבדיקת ההתקשרות.
3. טיטרציה נוגדנים
   1. לדלל את נוגדן GII האנטי-אנושי המצומד פי 100, עם דילול התחלתי של 1:100 ודילול סיום של 1:600 (שישה דילולים בסך הכל).
   2. בצע בדיקת קובץ מצורף לווירוסים כמתואר להלן למעט החריג הבא: בשלב 1.5.7, השהה מחדש את גלולת החיידקים ב- 350 μL של 5% BB.
   3. חלק את המדגם לשבעה aliquots 50 μL.
   4. הוסף 50 μL של כל דילול נוגדנים לצינור אחד.
   5. הוסף 50 μL של 5% BB לצינור השביעי כבקרה לא מוכתמת.
   6. בצע ציטומטריית זרימה על כל הדגימות כמתואר להלן.
   7. השווה דגימות נוגדנים מדוללים לבקרות לא מוכתמות וזו לזו. יש לבחור את ריכוז הנוגדנים הנמוך ביותר שאינו גורם לירידה או אובדן של אות חיובי לבדיקות הבאות.
4. הכנת חיידקים
   1. לגדל את החיידקים ב 40 מ"ל של תווך נוזלי מתאים בתנאים אטמוספריים נאותים עד שהחיידקים נמצאים בשלב נייח.
      1. לגדל תרביות Enterobacter cloacae באופן אירובי לילה במרק לוריא ב 37 ° C, רועד ב 200 סל"ד כדי להגיע לשלב נייח.
      2. לגדל תרביות לקטובצילוס גסרי במרק דה מאן, רוגוסה ושארפ (MRS) בצינורות פקק בורג שחור מבלי לרעוד באמבט מים המוגדר ל -37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות כדי להגיע לשלב הנייח.
   2. העבר תרביות פאזה נייחות לניקוי צינורות חרוטיים של 50 מ"ל ודגימות צנטריפוגות ב -2,288 x גרם למשך 10 דקות כדי לגלול את החיידקים.
   3. הסר את supernatant ו resuspend אותו ב 13 מ"ל של סטרילי 1x PBS. חזור על שלב השטיפה במשך שתי שטיפות בסך הכל.
   4. צנטריפוגר את הדגימות שוב, להסיר את supernatant, ולהשעות מחדש את הדגימות ב 20 מ"ל של 1x PBS.
      הערה: אם גלולת התא קטנה, ניתן להקטין את נפח ההשעיה.
   5. מדוד את OD₆₀₀ של התרבות.
   6. באמצעות עקומה סטנדרטית, קבע את יחידת יצירת המושבה (CFU) לכל מ"ל של התרבית השטופה.
   7. לדלל את החיידקים עם 1x PBS כדי להתאים את ריכוז התרבית ל 1 x 10⁸ CFU/mL.
   8. העבר 1 מ"ל של תרבית חיידקים 1 x 10⁸ CFU/mL לצינורות הצנטריפוגות הנדרשות של 1.5 מ"ל.
   9. צנטריפוגה את הצינורות ב 10,000 x גרם במשך 5 דקות.
   10. להשהות מחדש את גלולת החיידקים ב 1 מ"ל של סטרילי 5% BSA.
   11. לדגור את הצינורות במשך 1 שעה ב 37 ° C עם סיבוב קבוע.
5. קובץ מצורף לווירוסים
   1. עבודה בתוך ארון בטיחות ביולוגית BSL-2, להוסיף 10 מיקרוגרם של נורו-וירוס אנושי (HuNoV) VLPs (ראה טבלת חומרים) לכל צינור המכיל חיידקים מרחפים מחדש ב- PBS ולערבב היטב על ידי pipetting.
      הערה: ריכוז VLP משתנה עם כל תכשיר VLP. לכן, הנפח שיתווסף לחיידקים ישתנה בין אצוות הכנה ויש לכוונן בהתאם כך שיתווספו 10 מיקרוגרם לכל צינור בניסוי. עבור בקרות של חיידקים בלבד (למשל, דגימות ללא VLP), הוסף נפח של PBS השווה לנפח של VLP שנוסף לדגימות ניסיוניות.
   2. צינורות לדגור במשך 1 שעה ב 37 ° C עם סיבוב קבוע.
      הערה: אקדח צינור (ראה טבלת חומרים) המוגדר ל-40 סל"ד משמש במהלך הדגירה.
   3. לאחר הדגירה, צנטריפוגו את הדגימות ב 10,000 x גרם במשך 5 דקות.
   4. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את כדורית החיידקים ב-1 מ"ל של PBS.
   5. חזור על שלבי הכביסה 1.5.3 ו- 1.5.4.
   6. צנטריפוגה את הדגימות ב 10,000 x גרם במשך 5 דקות.
   7. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את כדורי החיידקים ב-150 מיקרוליטר של 5% BB.
6. הכתמת נוגדנים
   1. הכינו טרי 5% BB.< בר/> הערה: כל העבודה באמצעות נוגדן מתויג פלואורסצנטי צריכה להתבצע בחושך, ואת הנוגדן, BB, ו FCSB צריך להישמר על קרח.
   2. נוגדן GII אנושי נורו-וירוס אנושי 1:125 עבור דגימות E. cloacae ו-1:150 עבור דגימות L. gasseri ב-5% BB, הכנת 50 μL של נוגדן מדולל לדגימה.
   3. לדלל את נוגדן האיזוטיפ באותו אופן שבו נוגדן הנורו-וירוס GII האנושי דולל עבור כל חיידק ב-5% BB, והכין 50 מיקרוליטר של בקרת איזוטיפ מדולל לדגימה.
   4. חלק כל דגימת בדיקת התקשרות משלב 1.3.7 לשלושה אליציטוטים של 50 מיקרוליטר על ידי העברתם לצינורות צנטריפוגות נקיים של 1.5 מ"ל.
   5. לקבוצה הראשונה של דגימות, להוסיף 50 μL של BB. קבוצה זו תהיה פקדי Unstained (Uns).
   6. הוסף 50 μL של דילול נוגדנים GII לקבוצה השנייה. התוצאה היא ריכוז נוגדנים סופי של 1:250 עבור E. cloacae ו-1:300 עבור L. gasseri. קבוצת דגימות זו תהיה הדגימות המוכתמות (AB).
   7. הוסף 50 μL של נוגדן איזוטיפ מדולל לקבוצה השלישית. קבוצה זו תהיה פקדי איזוטיפ (IC). מערבבים היטב על ידי pipetting. לדגור על הדגימות על קרח ובחושך במשך 30 דקות.
   8. צנטריפוגה כל הדגימות ב 10,000 x גרם במשך 5 דקות.
   9. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הדגימות ב-100 מיקרוליטר של FCSB.
   10. צנטריפוגה של כל הדגימות במהירות של 10,000 x גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הדגימות ב-100 מיקרוליטר של FCSB.
   11. צנטריפוגה כל הדגימות ב 10,000 x גרם במשך 5 דקות.
   12. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הדגימות ב-150 מיקרוליטר של FCSB.
   13. העבר כל דגימה לצינור FCSB המכיל 400 μL של מאגר FCSB לקבלת נפח כולל של 550 μL.
   14. שמור דגימות ב 4 °C עד שהם מנותחים על ידי cytometry זרימה.
       הערה: ציטומטריית זרימה מבוצעת תוך 4 שעות מצביעת הנוגדנים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צינורות פוליסטרן בעלי תחתית עגולה 5 מ"ל עם מכסה מסננת תאים	קורנינג	352235	לאחר צביעת נוגדנים, הדגימה מועברת לצינורות לניתוח ציטומטריית זרימה.
AnaeroPack	תרמו סיינטיפיק	R681001	חבילת גז אנאירובית המשמשת לתרבית של לקטובצילוס גסרי
תוכנת BD FacsDiva
ציטומטר זרימה BD LSR Fortessa
אלבומין בסרום בקר	פישר ביוריאגנטים	BP1605	משמש לציטומטריית זרימה
מאגר כתמים של ציטומטריה של זרימה (FCSB)	BD Biosciences	554657	משמש לציטומטריית זרימה
עכבר IgG2b kappa איזוטיפ שליטה (eBMG2b), PE, eBioscience	תרמו פישר סיינטיפיק	12473281	בקרת איזוטיפ. נוגדן זה נרכש בצורה מצומדת מהיצרן.
אבקת MRS	BD Biosciences	288130	משמש להכנת מדיה ולתרבית לקטובצילוס גסרי.
נוגדן חד-שבטי Norovirus capsid G2 (L34D)	תרמו פישר סיינטיפיק	MA5-18241	נוגדן GII Norovirus. נוגדן זה זמין רק בצורה לא מצומדת ולכן חייב להיות מצומד פלואורסצנטית לפני השימוש במבחני ציטומטריית הזרימה המתוארת. בפרוטוקול זה, PE היה הפלואור שנבחר, עם זאת, מולקולות פלואורסצנטיות אחרות יכולות להיבחר כמתאימות ביותר לציטומטר הזרימה המשמש את החוקר.
Norovirus GII.4 VLP	מבנה ביולוגי יצירתי	CBS-V700	וירוס נורו-וירוס אנושי כמו חלקיק, VLPs נוצרו באמצעות מערכת baculovirus והושהו מחדש במי מלח חוצצים פוספט עם 10% גליצרול. המחברים ביצעו ניתוח מעקב ננו-ראייה עצמאי כדי לקבוע את ריכוז החלקיקים של ה-VLPs. הריכוז הוא כ-1011 VLPs למיליליטר. בהתבסס על ריכוז החלבון של ה-VLPs, מתווספים כ-200 חלקיקים לכל חיידק במבחני התקשרות ל-VLP.
PBS 10X	פישר ביוריאגנטים	BP665	יש לדלל ל-1X לפני השימוש.
ערכת סימון נוגדנים R-PE של SiteClick	תרמו פישר סיינטיפיק	S10467	ערכת צימוד המשמשת לעיבוד נוגדנים לא מצומדים.
נתרן כלורי	פישר סיינטיפיק	S271	משמש להכנת מדיה
טריפטון	אוקסואיד	LP0042	משמש להכנת מדיה
אקדח צינור	תרמופישר סיינטיפיק	88881001	משמש וירוס:בדיקת התקשרות חיידק. הגדר למהירות מרבית (40 סל"ד).
תמצית שמרים	BD Biosciences	212750	משמש להכנת מדיה
אגר	סיגמא	A7002	משמש להכנת מדיה