כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. הכנת מאגרים וריאגנטים
NOTE: הכן את כל הדגימות בהתאם להנחיות היצרן. במהלך הליך זה, יש ללבוש ציוד הגנה אישי (מעילי מעבדה, כפפות ומשקפי מגן).
- הכן את מאגר שטיפת הציטראט על-ידי שילוב של 0.941 גרם סוכרוז (ריכוז סופי של 11 מילימול), 6.4 מ"ל נתרן כלורי של 5 מ"ל (NaCl, 128 מ"ל סופי), 5.4 מ"ל של 0.2 מטר מונוסודיום פוספט (NaH2PO4, 4.3 מ"ל סופי), 9.4 מ"ל של 0.2 מ"ל דיסודיום פוספט (Na2HPO4, 7.5 מ"ל סופי), 0.352 גרם נתרן ציטראט (4.8 מ"ל סופי), ו 0.115 גרם של חומצת לימון (2.4 mM סופי). התאם את עוצמת הקול הכוללת ל- 250 מ"ל עם ddH2O. סנן דרך דיסק מסנן של 0.45 מיקרומטר וכוונן את ה- pH ל- 6.5. יש לאחסן עד שנה אחת בטמפרטורה של 4°C. יש להביא את התמיסה לטמפרטורת החדר (RT) לפני השימוש.
- הכן את חיץ הקרע על ידי שילוב של 250 mM סוכרוז, 1 mM אתילאנדיאמין חומצה טטראצטית (EDTA), ו 10 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride (Tris-Cl, pH 7.4) בנפח סופי של 100 מ"ל. יש לאחסן עד שנה בטמפרטורה של 4°C. הוסיפו 2 μL של קוקטייל מעכבי פוספטאז (1:1000 סופי) ו-1 μL של קוקטייל מעכבי פרוטאז (1:2000 סופי) לתוך 2 מ"ל של חיץ קרע. יש לשמור על קרח עד לשימוש. מחק את מאגר הקרע שאינו בשימוש.
2. בידוד טסיות
- יש לאסוף 8-10 מ"ל דם אנושי בצינורית איסוף דם צהובה המכילה תמיסת חומצה-ציטראט-דקסטרוז (ACD) (75 מ"מ טריסודיום ציטראט, 124 מ"מ דקסטרוז ו-38 מ"מ חומצת לימון, pH = 7.4; ACD: דם = 1:9). מערבבים בעדינות את תכולת הצינור 5x-6x היפוך ביד.
- צנטריפוגה את הצינורות ב 200 x גרם ברוטור דלי מתנדנד במשך 20 דקות ב RT.
- אספו פלזמה עשירה בטסיות דם (PRP) (~3-4 מ"ל) לתוך צינור תחתון חרוטי של 15 מ"ל והשאירו כ-0.5 מ"ל של PRP מהפרווה הבאפית (חלק מעורפל למראה) כדי למנוע זיהום. אם מתרחש זיהום כלשהו בתאי הדם האדומים, חזור על שלב זה.
- צנטריפוגה את דגימות PRP ב 1,200 x גרם במשך 15 דקות ב RT.
- שטפו את כדורי טסיות הדם (P1) על ידי מתלה עדין ב-1 מ"ל של חיץ שטיפת ציטראט וגלולה בצנטריפוגה במהירות של 1,200 x גרם למשך 15 דקות ב-RT.
- שמור את כדור טסיות טהור. השליכו את הסופרנטנט.
- יש להשהות מחדש את כדורי הטסיות ב-600 מיקרוליטר של חיץ הקרע המכיל קוקטיילים מעכבים.
- סוניק את מתלה טסיות הדם באמצעות סוניקטור. הניחו את הדגימה בדלי קרח קטן. הגדר את הסוניקטור להגדרה 3 עבור 20 שניות במצב רציף.
הערה: נקו את הבדיקה עם 10% אקונומיקה ואחריה מים מזוקקים.
- צנטריפוגה את הדגימות הסוניק ב 20,000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C כדי להסיר שברים קרומיים. Aliquot supernatants ב 60 μL ולאחסן ב -80 ° C. הימנע מחזורי הפשרה / הקפאה חוזרים עבור שברים cytosolic טסיות.
3. הכנה לאלקטרופורזה נימית immunoassay (CEI)
הערה: 100 μL של טסיות דם אנושיות שולבו מחולי ALS (n = 8-10), ונבדקים בריאים (n = 8-10) אוגמו בנפרד ושימשו לאופטימיזציה של הבדיקה.
- מלא תבניות שנוצרו בתוך החברה עבור פריסת CEI (טבלה 1) והכנת דוגמאות (טבלה 2). טבלת הכנת תערובת הדגימה היא דינמית ותחשב באופן אוטומטי כמה נפח יש להסיר מהמקור.
הערה: כאשר אמצעי האחסון של המקור הנדרש מוזן בטבלה דינמית 2, נפח מאגר מדגם 0.1 X יחושב באופן אוטומטי.
- תווית מראש 25 צינורות PCR 0.2 מ"ל עם נימים #1–#25 והניחו אותם במדף PCR. מונח על קרח.
- לפני התווית צינורות מיקרוצנטריפוגות 0.6 מ"ל: אחד לכל נוגדן ראשוני ודילול (במידת הצורך) לשימוש, אחד עבור מאגר הדגימה 0.1x, אחד עבור luminol-S / חמצן, ואחד עבור כל דגימה להיות מדולל (במידת הצורך). הניחו אותם על קרח במדף צינורות.
- הוציאו את מאגר הדגימה, מאגר השטיפה, צלחת אחת ומחסנית שסופקו במודול ההפרדה של ערכת האב CEI 12–230 kDa .
- מהמקרר בטמפרטורה של 4°C, הוציאו את מאגר דילול הנוגדנים, הנוגדנים הראשוניים, הנוגדנים המשניים, הלומינול, מי החמצן והאריזה הסטנדרטית. הניחו את כל הריאגנטים על קרח למעט האריזה הסטנדרטית, שנשארת ב-RT.
הערה: הריאגנטים מהאריזות הסטנדרטיות עוברים ליופיליזציה ואטומים עם כיסוי נייר כסף. כדי להפחית את אובדן המוצר, יש לסובב אותם לזמן קצר באמצעות מיני צנטריפוגה לפני הפתיחה. כדי לפתוח, צינורות מגיב יכול להיות מנוקב על ידי קצה פיפטה או למשוך אחורה מהפינה.
- כדי להכין את 400 mM dithiothreitol (DTT), להוסיף 40 μL של מים deionized לצינור שקוף המכיל את DTT.
- כדי להכין 40 μL של תערובת מאסטר פלואורסצנטית 5x, הוסף 20 μL של מאגר הדגימה 10x ו- 20 μL של תמיסת DTT 400 mM מוכנה לצינור הוורוד המסופק בערכה.
- כדי להכין את סולם הביוטינילציה, הוסף 16 μL של מים נטולי יונים, 2 μL של חיץ דגימה 10x ו- 2 μL של תמיסת DTT 400 mM מוכנה לצינור הלבן המסופק בערכה. יש לערבב בעדינות ולהעביר לצינור תגובת שרשרת פולימראז (PCR) בנפח 0.2 מ"ל לצורך דנטורציה.
- הכן מאגר דגימה של 0.1x על ידי הוספת 1.5 μL של מאגר דגימה 10x ו- 148.5 μL של מים נטולי יונים, לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 0.6 מ"ל. מערבולת לערבב ולהניח על קרח.
- הכינו את דילולי הנוגדנים הרצויים. יש להוסיף נוגדנים מדללים בנפחים המיועדים לכל צינור מיקרו-צנטריפוגה שסומן מראש. אם הנפחים זהים, השתמש בטכניקת הפיפטינג ההפוך; אם לא, יש לשטוף מראש את קצה פיפטה לפני הניפוק.
הערה: בבדיקה זו נעשה שימוש בנוגדן מחבת A-TDP-43 ובנוגדן TDP-43 מסוג A-P(S409/410-2). נוגדן Anti-ERK שימש לבקרה פנימית כדי להבטיח שרכיבי הבדיקה פועלים.
- בצע את הפיפטינג ההפוך לדילול נוגדנים כמתואר להלן. לחלופין, מידע נוסף ניתן למצוא בספרות.
הערה: צנרת הפוכה עדיפה בעת חלוקת נפחים רציפים קטנים של תמיסות. טכניקה זו מציעה כמה יתרונות: (i) מתן נפח מדויק, (ii) ביטול קצף מגיב בפתח הקצה, ו (iii) אידיאלי עבור ריאגנטים נפח קטן (<5 μL), תמיסות צמיגות, תמיסות פעילי שטח, ותמיסות עם לחץ אדים גבוה.
- שים קצה מתאים פיפטה ולחץ על הבוכנה למטה לתחנה השנייה (שלב 2). לטבול את קצה הצינור כמה מילימטרים לתוך הפתרון. שחררו באיטיות את הבוכנה כדי למלא את קצה הפיפט בתמיסה בזמן שהקצה עדיין שקוע. הסר את הקצה מהתמיסה וגע בעדינות בקצה מאגר המגיבים כך שעודפי הנוזלים שנותרו בצד החיצוני של הקצה יוסרו.
- חלק את הפתרון על ידי לחיצה על הבוכנה לתחנה הראשונה (שלב 1). אל תוותרו על הפתרון שנותר בקצה.
- רוקן את התמיסה הנותרת בקצה למאגר מגיב על ידי לחיצה על הבוכנה לתחנה השנייה (שלב 2). שחררו את הבוכנה למצב מוכן לשלב הפיפטינג הבא.
- הוסף את הנוגדן הנדרש בנפחים המיועדים לכל צינור מיקרוצנטריפוגה מסומן מראש (טבלה 1). אין לשטוף מראש את קצה הפיפט: יש להוסיף אותו ישירות לדילול ולשטוף את החוד מספר פעמים כדי להסיר את הנוגדן. מניחים את הצינורות על קרח.
- כדי להכין את תערובת הדגימות של CEI, בצע את השלבים המפורטים להלן עבור צינורות PCR המסומנים cap#2 עד cap#25: סדר זה זהה לזה שבטבלה 1.
- פתח את כל הצינורות, הוסף 1.6 μL aliquots של חיץ דגימה פלואורסצנטי 5x לכל צינור באמצעות טכניקת צנרת הפוכה, ולאחר מכן סגור כל צינור PCR עם הוספת חיץ 5x כדי למזער את אובדן הדגימה.
- פתח את כל הצינורות, הוסף מאגר דגימה 0.1x בנפחים המצוינים בטבלה 2 לכל צינור, ולאחר מכן סגור מיד לאחר מכן. אם הנפחים זהים, השתמש בטכניקת פיפטינג הפוך. אם לא, שטפו מראש את קצה הפיפט לפני חלוקת מאגר דגימה של 0.1x.
- פתחו את כל הצינורות, הוסיפו דגימת חלבון בנפחים המסומנים בטבלה 2 לכל צינור, וסגרו מיד לאחר מכן. אם הנפחים זהים, השתמש בטכניקת הצנרת ההפוכה. אם לא, שטפו מראש את קצה הפיפט לפני חלוקת מאגר דגימה של 0.1x.
- צנטריפוגה קצרה של כל צינורות ה-PCR בצנטריפוגה (13,000 x גרם למשך 30 שניות), פליק/מערבולת צינורות PCR לערבוב, ואז לחזור על הצנטריפוגה.
- להעביר את כל צינורות PCR לתוך thermocycler עם מכסה מחומם. דגימות דה-נטורציה בטמפרטורה ומשך מוגדרים (כלומר, 95°C למשך 5 דקות; 70°C למשך 10 דקות).
הערה: טמפרטורת הדנטורציה ומשך הזמן חייבים להיות ממוטבים עבור חלבון היעד.
- חזור על שלב 3.12.4.
- החזר את כל צינורות ה- PCR למדף הצינור והנח אותם על קרח.
- במהלך שלב הדנטורציה, הכינו את תמיסת הפיתוח (1:1 luminol-S: תמיסת מי חמצן), ולאחר מכן הוסיפו 200 μL של luminol-S ו-200 μL של מי חמצן. מניחים על קרח.
- כדי לטעון צלחת ממולאת מראש של CEI עם הדגימה שהוכנה לעיל, חלק ריאגנטים ודגימות לתוך צלחת הבדיקה המוצגת בפריסת הבדיקה (איור 1). הימנעו מהחדרת בועות אוויר.
הערה: אם אמצעי האחסון והתמיסה זהים, השתמש בטכניקת פיפטינג הפוך. אם לא, שטפו מראש את קצה הפיפט לפני הניפוק, ואל תוציאו את השארית לצלחת היטב באמצעות מעצור הלשונית השני על הפיפטה. מודול הפרדה של 12-230 kDa עשוי להכיל מדריך טעינת לוחות מקודד בצבע. הניחו מדריך זה מתחת לצלחת תוך הוספת ריאגנטים ודוגמאות לבאר, מה שעוזר ויזואלית בעת טעינת הדגימה. את מדריך העמסת הלוחות ניתן להוריד גם מאתר החברה.
- הוסף 15 μL של luminol: תערובת מי חמצן לכל באר בשורה E.
הערה: באופן אידיאלי, הכינו מגיב זה ממש לפני השימוש והוסיפו אותו לכל באר. אם זה לא נוח, תערובת זו עשויה להיות מוכנה לא יותר מ 30 דקות לפני טעינת הצלחת.
- בשורה D, לבאר D1, להוסיף 10 μL של streptavidin-HRP.
- בשורה D, לבארות D2–D25, הוסיפו 10 μL של נוגדן משני ייעודי.
- בשורה B, להוסיף 10 μL של נוגדנים מדלל לכל באר.
- בשורה C, כדי גם C1, להוסיף 10 μL של נוגדנים מדללים.
- בשורה C, לבארות C2-C25, להוסיף 10 μL של נוגדן ראשוני ייעודי.
- בשורה A, כדי באר A1, להוסיף 5 μL של סולם biotinylated מ PCR צינור #1.
- בשורה A, לבארות A2-A25, הוסף 3 μL של הדגימה, צינורות PCR #2-#25 לבארות מתאימות #2-#25.
- הוסף 500 μL של חיץ כביסה לכל חיץ כביסה ייעודי היטב.
- צנטריפוגה את הצלחת למשך 5 דקות ב 1,000 x גרם ב RT.
טבלה 1: תבנית טעינת צלחת בדיקת CEI.
טבלה 2: תבנית אינטראקטיבית להכנת תערובת לדוגמה. לאחר הזנת ריכוז חלבון המלאי מדגימות לא ידועות, תאים אינטראקטיביים יחשבו באופן אוטומטי כמה נפח יש להשתמש כדי להכין את תערובת הדגימה.
