בדיקה חיסונית מגנטית מבוססת ננו-חלקיקים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי

1. הכנת המכשיר

1. ממלאים את התעלות במים מזוקקים באמצעות מזרק. ודא שאין דליפות או התנגדות לזרימה. טבלו את המכשיר באמבטיה על-קולית למשך 10 דקות כדי להסיר כל חומר אקרילי, דבק או לא רצוי שנותר בתוך התעלות.
2. רוקן את המים בתוך תעלות המכשיר. השתמש במזרק כדי להציג תמיסת חסימה שהוכנה עם אלבומין בסרום בקר (BSA) 5% (w/v) מדולל במי מלח חוצצים 1x Tris (TBS) וסונן בעבר דרך מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר פוליאתרסולפון (PES).
3. הכינו תרחיף של מיקרו-חלקיקי ברזל בקוטר 7.5 מיקרומטר ב-5% BSA.
   הערה: המיקרו-חלקיקים תפקדו בעבר עם שכבת סיליקה-פוליאתילן גליקול (PEG) המקנה עמידות לספיגת חלבונים.
4. לדגור את השבב ואת ההשעיה microparticle עם פתרון חסימה לפחות 1 שעה בטמפרטורת החדר. במידת האפשר, אפשר חסימה למשך הלילה ב-4°C.

2. היווצרות מלכודת מיקרו-חלקיקים

1. הכנס את המיקרו-חלקיקים לשבב באמצעות מחט מזרק דרך צינור היציאה בתעלה הצדדית. מקם את השבב אנכית ואפשר למיקרו-חלקיקים לזרום תחת השפעת כוח הכבידה דרך הערוץ הצדדי. סובב את השבב ב-180° בשני שלבים של 90° ואפשר למיקרו-חלקיקים להתמקד ולדחוס במגבלה של 5 מיקרומטר.
2. הסר מיקרו-חלקיקים עודפים על ידי סיבוב כוח הכבידה של 45° לכיוון הערוץ הצדדי.
3. שמור על ההתקן זקוף כדי למנוע ביטול מלכודת המיקרו-חלקיקים. ראו איור 1B לסיכום תהליך היווצרות מלכודת המיקרו-חלקיקים.

3. Immunoassay

1. הכנת ננו-חלקיקים
   1. קח 2 μL של תרחיף של 100 ננומטר חלקיקים מצומדים בעבר עם lysozyme (מודל אנטיגן). הוסף אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל עם 100 מיקרוליטר של פתרון חסימה. לדגור לילה ב 4 °C (75 °F).
   2. הוסף 150 μL של חיץ כביסה (1x כפות, 0.05% Tween 20).
   3. מקם את צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל במפריד מגנטי. שמרו במשך 15 דקות כדי לאפשר הפרדה של ננו-חלקיקים (איור 2).
      הערה: הנפח המינימלי עבור המפריד המגנטי הוא 200 μL. הימנע משימוש בנפח קטן יותר.
   4. הסר את הנוזל מן הצינור עם micropipette. יש להימנע ממגע עם דופן הצינור שבו נוצרה גלולת הננו-חלקיקים.
   5. הוסף 250 μL של חיץ כביסה טרי. שמור את הצינור תחת תסיסה במשך 15 דקות.
   6. חזור על שלבים 3.1.3.-3.1.5. פי 2 יותר, רועד רק במשך 5 דקות.
   7. הוסף את הריכוז הרצוי של נוגדן אנטי-ליזוזים ראשוני (ראה טבלת חומרים). יש לכוונן לנפח סופי של 100 μL בדילול נוגדנים (1x TBS, 1% BSA, 0.05% Tween 20).
   8. יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37°C. יש להמשיך לנער במשך 15 דקות נוספות בטמפרטורת החדר.
   9. חזור על שלבי הכביסה 3.1.2.-3.1.6.
   10. הוסף 100 μL של דילול נוגדנים. הוסף את הנוגדן המשני המצומד לפרוקסידז חזרת (HRP-AbII) (ראה טבלת חומרים) בדילול של 1:500.
   11. חזור על שלבי הכביסה 3.1.2.-3.1.6.
   12. שמור את הננו-חלקיקים בנפח סופי של 50 μL של דילול נוגדנים.

4. הרכבה ניסיונית

1. ממלאים את שני מזרקי הזכוכית 100 מיקרוליטר במים, מחברים צינור באורך 6.5 ס"מ לכל מזרק, מכניסים סיכת מתכת לקצה הצינור ומניחים את שני המזרקים על משאבת המזרק הנשלטת על ידי מחשב.
2. אטמו את כל הצינורות של המכשיר האקרילי בחום.
3. חותכים את צינור הכניסה ושומרים רק כמה מילימטרים. מלאו את מחט הניפוק בחיץ כביסה והכניסו אותה לצינור החתוך. יש לאפשר לתמיסה לטפטף לפני חיבור המחט למכשיר כדי למנוע כניסת אוויר למכשיר.
4. חתכו את צינור היציאה מהתעלה הרוחבית. התחברו למשאבת המזרק. לאחר מכן, בצע את אותו הליך עבור צינור שקע הערוץ הראשי.
   הערה: זהו המפתח לביצוע שלבים 4.3.-4.4. בסדר זה כדי למנוע פריקת מלכודת המיקרו-חלקיקים. במידת האפשר, ודא את מצב המלכודת במהלך שלבים אלה בעזרת זכוכית מגדלת.
5. הניחו מגלשת זכוכית על במת המיקרוסקופ. חבר את המגנט לשקופית עם סרט דו-צדדי והנח פיסת סרט קטנה בכל צד כדי לקבע את קצוות השבב לזכוכית.
6. הגדר קצב זרימה של 50 μL/h באמצעות הכרטיסיות קצב זרימה ויחידות בבקר משאבת המזרק. בחר במצב נסיגה ולחץ על התחל כפתור להפעלת זרימת מאגר הכביסה.
7. בזהירות, התקרבו למכשיר לכיוון המגלשה עם המגנט בצורה אופקית כך שאזור השבב המכיל את המלכודת יבוא במגע עם המגנט.
8. הדביקו את קצוות המכשיר לזכוכית באמצעות סרט דו-צדדי למניעת תנועה. הימנעו מחסימת הנתיב האופטי במיקרוסקופ (איור 1C).

5. זיהוי חיסוני

1. שמור על חיץ הכביסה זורם במשך 10 דקות במהירות של 50 μL/h כדי להסיר BSA עודף.
2. הסר את חיץ הכביסה שנותר ממחט הניפוק באמצעות מיקרופיפטה. הוסף 50 μL של תרחיף ננו-חלקיקים.
3. זרימה של תרחיף של ננו-חלקיקים במשך 7 דקות בקצב זרימה של 100 μL/h. לאחר מכן, שנו את קצב הזרימה ל-50 מיקרוליטר/שעה וזרמו למשך 15 דקות נוספות.
4. החלף את מחט הניפוק. הזרימו את מאגר הכביסה למשך 10 דקות במהירות של 50 מיקרוליטר/שעה. הכינו את המצע הפלואורוגני בהתאם למפרט היצרן בשלב הכביסה.
5. הסר את חיץ הכביסה שנותר ממחט הניפוק באמצעות מיקרופיפטה. הוסף 100 μL של המצע הפלואורוגני (ראה טבלת חומרים). הזרימו את המצע הפלואורוגני במשך 6 דקות במהירות של 50 מיקרוליטר/שעה.
6. הגדר את קצב הזרימה (1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h ו- 10 μL/h) ואת פרמטרי מדידת הזמן (6 דקות) בכרטיסיות קצב הזרימה המתאימות והגדר טיימר של הממשק השולטות במשאבת המזרק. הקפד לבחור מצב משיכה עבור כל אחת מהמדידות שיש לבצע.
7. הגדר לשונית קצב זרימה נוספת על 50 μL/h והגדר טיימר על 3 דקות לשלב השטיפה.
8. הפעל את הפלואורסצנטיות של המיקרוסקופ 15 שניות לפני שהמצע ב 50 μL / h נעצר. התחל את צילום התמונה עם התוכנה של מצלמת המיקרוסקופ 10 שניות לפני שהמצע נעצר עם זמן חשיפה של 1,000 אלפיות השנייה. בצע הדמיה במשך 6 דקות ב- 1 frame/s (FPS).
9. לחץ על כפתור התחל של פרמטר קצב הזרימה הרצוי מיד לאחר עצירת קצב שטיפת המצע ב- 50 μL / h. לחץ על כפתור התחל של זרימת השטיפה (50 μL / h) מיד לאחר הפסקת זרימת המדידה שנבחרה.
10. עצור את לכידת התמונה וכבה את הפלואורסצנטיות של המיקרוסקופ כדי למנוע הלבנה של המצע.
11. חזור על שלבים 5.8.-5.10. עבור כל קצב זרימת מדידה בשימוש.

איור 1: תצורת ההתקן הסופית. (A) התקן אקרילי עם הצינורות המחוברים לכניסות וליציאות המתאימות. קנה המידה מציג את ממדי המכשיר בסנטימטרים. (B) פרוטוקול להיווצרות מלכודת מיקרו-חלקיקים. מיקרו-חלקיקים זורמים דרך הערוץ על ידי כוח הכבידה כאשר המכשיר ממוקם במצב אנכי. מיקרו-חלקיקים מרוכזים בהגבלה של 5 מיקרומטר. מיקרו-חלקיקים עודפים מוסרים בקלות על ידי סיבוב השבב דרך הערוץ הצדדי. השבב נשמר אנכי כדי לשמר את המלכודת לפני החיסון. (C) מכשיר מיקרופלואידי המורכב על מגלשת זכוכית המכילה את המגנט, על במת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי ההפוך. מחט הניפוק שדרכה מתווספים הריאגנטים נצפית, כמו גם צינורות היציאה המתחברים למשאבת מזרק.

איור 2: הפרדת ננו-חלקיקים. באמצעות מפריד מגנטי מסחרי, ננו-חלקיקים של 100 ננומטר יכולים להיות מרוכזים בקלות כדי לבצע את שלבי השטיפה במהלך החיסון. הגלולה שנוצרה לאחר 15 דקות נצפתה בעיגול האדום.