טכנולוגיית Snap Chip לאימונואסאי סנדוויץ' מרובב ללא תגובתיות צולבת

תקציר

מקור: Li, H. et al., Snap Chip for Cross-reaction-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays.J. Vis. Exp. (2017)

הסרטון מציג את היישום של טכנולוגיית שבב סנאפ עבור חיסונים של סנדוויץ' מרובב ללא תגובתיות צולבת. הפעולה הפשוטה של הצמדת שתי שקופיות מיקרו-מערך, שכל אחת מהן מכילה ריאגנטים שונים, מבטיחה העברת מגיבים ללא זיהום צולב ומסייעת לזהות חלבונים מרובים באמצעות אימונואסיית סנדוויץ'.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. ייצור ואחסון של שבבי הצמדה

1. שיטת העברה יחידה (איור 1a)
   1. תמיסות cAb נקודתיות המכילות נוגדנים של 400 מיקרוגרם/מ"ל ו-20% גליצרול במי מלח חוצצי פוספט (PBS) על גבי בדיקת ניטרוצלולוז (או זכוכית פונקציונלית) מחליקות עם ספוטר microarray של הזרקת דיו בלחות יחסית של 60% (1.2 nL לכל נקודה) עם מרווח של 800 מיקרומטר ממרכז למרכז. ודא שהשקופית קבועה על סיפון התצפית לפי פינה אחת (כאן, נעשה שימוש בפינה השמאלית התחתונה).
   2. דגרו על מגלשת הבדיקה המנומרת בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת עם לחות יחסית של 60%.
   3. הדקו אטם מודול שקופיות עם 16 תאים בשקופית הבדיקה כדי לחלק אותו ל -16 בארות. שטפו את המגלשה שלוש פעמים על ידי הוספת 80 מיקרוליטר של PBS המכיל 0.1% Tween-20 (PBST) לכל באר, וניעור ב-450 סל"ד בשייקר, 5 דקות בכל פעם.
   4. הוסיפו 80 מיקרוליטר של פתרונות חסימה לכל באר ונערו במשך שעה אחת ב-450 סל"ד.
   5. הסר את האטם וייבש את שקופית הבדיקה עם זרם של חנקן.
   6. תקן שקופית העברה בסיפון התצפיתנים ודחוף את הפינה השמאלית התחתונה של המגלשה כנגד הפינה השמאלית התחתונה של סיפון התצפית. הזרקת דיו מזהה מערך של סימני יישור (תמיסה של מיקרו-חרוזי פוליסטירן) עם פריסה זהה לזו של נוגדני הלכידה (cAbs).
   7. הניחו לסימני היישור להתייבש. הפוך את שקופית ההעברה והחזיר אותה לסיפון התצפית, וקבע אותה בפינה השמאלית התחתונה.
   8. הכינו את תמיסות איתור הנוגדנים לזיהוי (dAb) המכילות נוגדנים של 20 מיקרוגרם/מ"ל, 20% גליצרול ואלבומין בסרום בקר 1% (BSA).
   9. באמצעות מצלמת התצפיתן, צלם תמונה של סימן יישור. הטמע תמונה זו בתוכנית האיתור כפידוקיאלי וקבל את מערכת זיהוי התמונה של ספוטר הזרקת הדיו כדי לזהות את הסימן השמאלי העליון. השתמש בקואורדינטה שלו כנקודה הראשונה של מערך dAb. נקודה 8 nL לכל טיפה עם מרווח ממרכז למרכז של 800 מיקרומטר.
2. שיטת העברה כפולה (איור 1b)
   1. מקם שקופית העברה 1 על סיפון ספוטר הזרקת הדיו בפינה השמאלית התחתונה. תמיסות cAbs נקודתיות המכילות נוגדנים של 400 מיקרוגרם/מ"ל, 20% גליצרול ו-1% BSA ב-PBS על גבי המגלשה עם ספוטר microarray בהזרקת דיו בלחות יחסית של 60% (0.4 nL לכל נקודה וקוטר ~200 מיקרומטר). המרווח בין מרכז למרכז הוא 400 מיקרומטר.
   2. הצמד את שקופית ההעברה באמצעות שקופית בדיקה מצופה ניטרוצלולוז (או זכוכית פונקציונלית) באמצעות מנגנון הצמדה (איור 2) כדי להעביר את טיפות ה- cAb לשקופית הבדיקה.
      1. סובב את כל ששת הכפתורים בצד של מנגנון ההצמדה ב- 90 מעלות כדי למשוך ולנעול את כל הבוכנות במצב פתוח. הכנס את שקופית ההעברה למחזיק השקופיות בכלי הקיבול שלה כשהפינה החתוכה פונה לפין הפוגו הקבוע. סובב את הסט הראשון של שלושת הכפתורים כדי לשחרר את הבוכנות עם סיכת הפוגו המוזהבת וודא שהשקופיות נלחצות כנגד פיני היישור.
      2. הכנס שקופית מצופה ניטרוצלולוז למנגנון ההצמדה הפוך כשהוא יושב על 4 פיני הפוגו. סובב את הקבוצה השנייה של שלושת הלחצנים כדי לשחרר בוכנות עם הסיכה הכסופה וודא שהשקופיות נלחצות כנגד פיני היישור.
      3. סגור את מנגנון ההצמדה על-ידי הנחת המעטפת העליונה על מחזיק השקופיות באמצעות עמודי היישור והחורים לקבלת מיקום מדויק.
      4. הכנס את מנגנון ההצמדה הסגור לכלוב שלו ודחוף את לשונית הסגירה לחלוטין כלפי מטה כדי להביא את המיקרו-מערכים פנים אל פנים תוך הפעלת הלחץ המתאים. יש לשמור סגור למשך דקה.
   3. הפרד בין השקופיות. דגרו על שקופית הבדיקה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת עם לחות יחסית של 60%. שטף, חסום וייבוש של שקופית הבדיקה כמתואר בשלבים 1.1.3 - 1.1.5.
   4. הנח שקופית העברה נוספת על סיפון ספוטר הזרקת הדיו ודחוף לפינה השמאלית התחתונה. תמיסות dAb נקודתיות המכילות 50 או 100 מיקרוגרם/מ"ל נוגדנים (ראה טבלה 1), 20% גליצרול ו-1% BSA ב-PBS. ודא שכל נקודה היא 0.8 nL והמרווח בין מרכז למרכז הוא 400 מיקרומטר.
   5. אחסן את הבדיקה ואת שקופית ההעברה. יש לאטום את מגלשות הבדיקה וההעברה בשקית אטומה המכילה חומר ייבוש ולהכניס למקפיא בטמפרטורה של -20°C.

2. בדיקות חיסוניות מרובות עם שבבי הצמדה

1. אחזר את שקופית הבדיקה מהמקפיא. השאירו את השקית אטומה למשך 30 דקות עד שהמגלשה תגיע לטמפרטורת החדר.
2. הכינו תמיסות דגימה מדוללות סדרתיות של 7 נקודות על ידי זינוק חלבונים ב-PBS המכילים 0.05% Tween-20.
   הערה: כאן, גורם דילול פי 5 משמש. הריכוזים ההתחלתיים של כל חלבון מפורטים בטבלה 1.
3. הכן פתרונות לדוגמה לפי הצורך. לדוגמה, לדלל סרום אנושי 4 פעמים במאגר PBST.
4. הדקו אטם בן 16 תאים בשקופית המבחן.
5. מלאו טור אחד של 8 בארות ב-7 תמיסות דילול חלבונים ותמיסת חיץ PBST נטולת חלבון על ידי פיפטציה. פיפטה את הפתרונות לדוגמה ב 8 בארות אחרות על אותה שקופית.
   הערה: ניתן להתאים תמיסות של 80 μL לכל באר. ניתן להשתמש בשקופיות נוספות כדי למדוד דגימות נוספות בעת הצורך.
6. יש לדגור על הדגימות על שייקר ב-450 סל"ד למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר או למשך לילה ב-4°C. שטפו את המגלשה שלוש פעמים עם PBST על השייקר ב-450 סל"ד, 5 דקות בכל פעם. הסירו את האטם וייבשו את המגלשה תחת זרם של גז חנקן.
7. אחזר את שקופית ההעברה עם dAbs מהמקפיא. יש לשמור את השקית אטומה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, דגרו על המגלשה בתא סגור (למשל קופסת טיפים ריקה) המכילה 60% חרוזי ייצוב לחות למשך 20 דקות להחזרת נוזלים.
8. הצמד את שקופית ההעברה עם שקופית הבדיקה באמצעות מנגנון הצמדה (איור 2) כדי להעביר את טיפות dAb. ראה סעיף 1.2.2 להפעלת מנגנון ההצמדה.
9. הפרד בין השקופיות. דגרו על שקופית הבדיקה בתא סגור המכיל 60% חרוזי ייצוב לחות למשך שעה אחת. הדקו את מגלשת הבדיקה עם אטם בן 16 תאים ושטפו את המגלשה 4 פעמים באמצעות PBST על שייקר ב-450 סל"ד, 5 דקות בכל פעם.
10. פיפטה 80 מיקרוליטר של תמיסות המכילות 2.5 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטאווידין פלואורופור ב-PBS לכל באר. דוגרים במשך 20 דקות על שייקר ב-450 סל"ד.
11. שטפו את המגלשה 3 פעמים עם PBST ופעם אחת עם מים מזוקקים על השייקר ב-450 סל"ד. הסירו את האטם וייבשו את המגלשה באמצעות גז חנקן.

3. סריקת שקופיות וניתוח נתונים

1. סרוק את שקופית הבדיקה באמצעות סורק microarray פלואורסצנטי באמצעות לייזר של 635 ננומטר.
2. חלץ את עוצמת הרשת של כל נקודה באמצעות תוכנת ניתוח (למשל array-pro analyzer).
3. חשב את גבול הזיהוי (LOD) של כל חלבון באמצעות תוכנת סטטיסטיקה וקבע את ריכוזי החלבונים בדגימות.
   הערה: LOD מוגדר כיירוט Y של עקומת התקן המוגדל פי שלושה מסטיית התקן של שלוש בדיקות בלתי תלויות.

טבלה 1. ריכוזי חלבונים ו-LODs בחיץ מבדיקת 50-plex. LOD עבור CA 15-3 הוא U/ml (*).

שם חלבון	ריכוז התחלתי (נ"ג/מ"ל)	לוד (PG/מ"ל)	שם חלבון	ריכוז התחלתי (נ"ג/מ"ל)	לוד (PG/מ"ל)
אנג2	500	1.3 × 104	IL-6ב	1	2.1 × 102
BDNF	500	1.0 × 102	IL-5	50	77
CA 15-3*	1	4.9 × 103	IL-4	1000	1.5 × 104
CEA	1000	5.4 × 103	IL-2	50	76
CXCL10/IP-10	50	1.7 × 102	LEP	200	4.0 × 102
CRP	200	44	מיג	500	11 × 102
אנגלית	1000	6.2 × 102	CCL3/MIP-1α	50	3.3
EGF	50	1.8 × 102	CCL4/MIP-1β	50	12
EGFR	200	1.9 × 102	MMP-3	500	1.0 × 102
FAS-L	500	4.5 × 102	M-CSF	500	8.2 × 103
FGF	500	1.0 × 103	MMP-9	200	3.1 × 102
G-CSF	500	39	CCL2/MCP-1	50	55
GM-CSF	50	3.8	NCAM-1	500	1.7 × 103
גרו-α	50	3.0 × 102	β-NGF	200	1.4 × 103
HER2	500	3.5 × 103	NT-3	200	5.8 × 102
PDGF-BB	200	73	OPN	500	1.9 × 103
IL-1β	500	7.9 × 102	RBP4	200	1.2 ×102
IL-1ra	200	1.1 × 103	SPARC	1000	4.6 ×104
IL-15	50	8.2 × 102	TNF-α	50	4.4
IL-12	1	30	TNF-RI	50	1.3 × 102
IL-11	500	1.2 × 103	TNF-RII	50	12
IL-10	500	6.1 ×102	FAS/TNFRSF6	200	2.8 ×102
IL-8	50	6.6	uPA	200	24
IL-7	2.5	26	uPAR(CD87)	200	76
IL-6א	1000	84	VEGF	200	6.7 × 102

תוצאות

איור 1. סכמטיות של הליך הבדיקה המשווה בין (א) שיטות העברה בודדות ו-(ב) כפולות.

איור 2. סכמטי המציג הבדלים בין העברה יחידה להעברה כפולה.(א) שיקוף ריאגנטים של העברה מגביר את חוסר ההתאמה הזוויתי בין השקופית לשלב הזרקת הדיו XY. (ב) שיטת העברה כפולה מתגברת ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
טבלית מלח חוצצת פוספט	פישר סיינטיפיק	5246501EA
Cy5 מצומד סטרפטאווידין	רוקלנד	S000-06
טווין-20	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 1379
אלבומין בסרום בקר	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc	001-000-162
גליצרול	סיגמא-אולדריץ'	G5516
פתרון חסימה: מייצב Microarray ללא BSA StabilGuard Choice	SurModics, Inc	SG02
שקופיות מצופות ניטרוצלולוז	גרייס ביו-מעבדות, Inc	305116
שקופיות מצופות Aminosilane	שוט, צפון אמריקה	1064875
התקן הצמדה	Parallex BioAssays Inc.	PBA-SD01
ספוטר microarray הזרקת דיו	GeSiM	ננופלוטר 2.0
אטם מודול שקופיות	גרייס ביו-מעבדות, Inc	204862
חרוזי ייצוב לחות	Parallex BioAssays Inc.	PBA-HU60
תוכנת Array-Pro Analyzer	קיברנטיקה תקשורתית	גרסה 4.5
סורק microarray פלואורסצנטי	אג'ילנט	סורק Microarray של SureScan
תוכנת ביוסטטיסטיקה	תוכנת GraphPad	GraphPad פריזמה 6
אנדוגלין לוכד נוגדנים	מערכות מו"פ	MAB10972
חלבון אנדוגלין	מערכות מו"פ	1097-EN
נוגדן לזיהוי אנדוגלין	מערכות מו"פ	BAF1097
IL-6a (ראה טבלה 1)	מערכות מו"פ
IL-6b (ראה טבלה 1)	Invitrogen