כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. הכתמה בנוגדן הראשון
- שקופיות Dewax ו-rehydrate משובצות פרפין קבוע פורמלין (FFPE) עם 5 דקות מוקצות לכל אחד מהשלבים הבאים: קסילן או ריאגנטים שווי ערך 3x, 100% אתנול 2x, 95% אתנול 1x, 70% אתנול 1x, 50% אתנול 1x, ומים מזוקקים 2x.
הערה: המגלשות צריכות להישאר לחות החל משלב זה של החזרת נוזלים ועד להרכבה בשלב האחרון.
- לשליפת אנטיגן אופציונלית, מקם את המגלשות בתמיסת נתרן ציטראט רותחת בנפח 275 מ"ל (10 mM, pH = 6.0) למשך 8 דקות. כדי לשמור על התמיסה רותחת, הניחו את המגלשות שטוחות בתחתית קופסת קצה פיפטה בגודל 14 x 9.5 x9 ס"מ עם מכסה וחממו את התמיסה בעוצמה של 70% בתנור מיקרוגל של 700W למשך 8 דקות. לאחר מכן הוציאו את קופסת קצה הפיפט מתנור המיקרוגל, פתחו את המכסה ותנו לתמיסה להתקרר בטמפרטורת החדר (RT) למשך 20 דקות לפחות.
- מעבירים את המגלשות לצנצנת קופלין המכילה PBST (מלח חוצץ פוספט עם 0.1% פוליסורבט 20/80). יש לשטוף עם PBST במשך 5 דקות 3x. אם לא עוברים מיד לשלב הבא, אחסנו את השקופיות בשלב זה עם PBST בצנצנת קופלין ב-RT למשך מספר שעות או בטמפרטורה של 4°C למשך 1-2 ימים אם לא עוברים מיד לשלב הבא.
- כדי להכין את הפתרון החוסם, השתמש בסרום הרגיל של המין המארח של הנוגדן המשני כמגיב החוסם. ניתן להשתמש גם בריאגנטים מסחריים אחרים. אם אתם משתמשים בסרום רגיל המשמש למחקר שהוצג במחקר זה, הוסיפו 100 מיקרוליטר של סרום חמורים רגיל ל-4.9 מ"ל PBST. ניתן לאחסן את פתרון החסימה ב -4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 ימים.
- לחסימה, נערו את ה- PBST מהשקופיות וכסו אותן במהירות בתמיסת חסימה מספקת. דגרו על המגלשות ב-RT בתא לח למשך 30 דקות.
- הכינו את תמיסת הנוגדנים הראשונית (500 מיקרוליטר לשתי שקופיות) באמצעות התמיסה החוסמת כדי לדלל את הנוגדן הראשוני לריכוז הרצוי. יש לאחסן את התמיסה על קרח עד לשימוש.
- עבור 3β-hydroxysteroid dehydrogenase (3βHSD), להוסיף 2 μL של נוגדן 3βHSD לתוך 498 μL של פתרון חוסם.
- עבור טירוזין הידרוקסילאז (TH), הוסף 0.5 μL של נוגדן TH לתוך 499 μL של תמיסה חוסמת.
- עבור β-catenin, להוסיף 1 μL של נוגדן β-catenin לתוך 499 μL של פתרון חוסם.
- עבור 20α-hydroxysteroid dehydrogenase (20αHSD), להוסיף 1 μL של נוגדן 20αHSD לתוך 499 μL של פתרון חוסם.
- עבור ציטוכרום P450 2F2 (CYP2F2), הוסף 2 μL של נוגדן CYP2F2 לתוך 498 μL של תמיסת חסימה.
- לדגור עם הנוגדן הראשוני על ידי ניעור התמיסה החוסמת מהמגלשות, ולכסות אותן במהירות בתמיסת נוגדנים ראשונית מספקת. לדגור את המגלשות בתא לח לילה ב 4 °C (75 °F). במהלך הדגירה ניתן לכסות את המגלשות בחתיכה קטנה של סרט פרפין כדי למנוע התייבשות.
- למחרת בבוקר לשטוף את המגלשות עם PBST במשך 5 דקות 3x.
- הכינו את תמיסת הנוגדנים השניונית (500 מיקרוליטר לשתי שקופיות) באמצעות התמיסה החוסמת כדי לדלל את הנוגדן המשני הביוטינילציה לריכוז הרצוי (למשל, 1 מיקרוליטר של נוגדן נגד חמור נגד עכבר או נוגדן נגד חמור ל 499 מיקרוליטר של תמיסה חוסמת). יש לאחסן את התמיסה על קרח עד לשימוש.
- לדגור עם הנוגדן השני על ידי ניעור PBST מן המגלשות וכיסוי מהיר שלהם עם תמיסת נוגדנים משנית מספקת. לדגור על המגלשות בתא לח למשך שעה אחת ב- RT.
הערה: אם ביוטין אנדוגני הוא בעיה, להשתמש נוגדן משני מצומד peroxidase במקום נוגדן משני biotinylated. דלג לשלב 1.14 אם אתה משתמש בנוגדן משני מצומד peroxidase בשלב 1.10.
- שטפו את המגלשות עם PBST במשך 5 דקות 3x.
- הכינו את תמיסת סטרפטאווידין מצומדת (SA-HRP) של חזרת (500 μL עבור שתי שקופיות) על ידי הוספת 0.5 μL של SA-HRP ל-499 μL של PBS. הריכוז הסופי הוא 1 מק"ג/מ"ל.
- דגור עם פתרון SA-HRP. נער את PBST מהשקופיות וכסה במהירות את המגלשות עם פתרון SA-HRP מספיק. דגרו על המגלשות בתא לח במשך 0.5 שעות ב- RT.
- שטפו את המגלשות עם PBST במשך 5 דקות 3x.
- הכינו את תמיסת הפלואורופור-טירמיד על ידי דילול פלואורופור-טירמיד עם חיץ הדילול שלו בהתאם להוראות היצרן (למשל, 5 מיקרוליטר של פלואורופור-טירמיד ל-496 מיקרוליטר של חיץ דילול).
- בצע את פיתוח האות עם פלואורופור-טירמיד על ידי ניעור PBST מהשקופיות וכיסוי מהיר של השקופיות בתמיסת פלואורופור-טירמיד מספקת. יש לדגור בתא לח למשך דקה אחת ב-RT. ניתן לכוונן את זמן הדגירה כדי לקבל את עוצמת הפלואורסצנטיות הרצויה. עצור את התגובה על ידי העברת המגלשות לצנצנת קופלין המכילה PBST. שטפו שקופיות עם PBST במשך 3 דקות 2x.
- ניתן לבדוק את האותות במהירות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאשר את התוצאה בשלב זה. אם לא נעשה שימוש בכיסויים, יש למרוח טיפה של גליצרול:PBS (1:1) על כל חלק כדי לשמור על לחות הדגימות. שטפו שקופיות עם PBST במשך 3 דקות 2x. ניתן לאחסן שקופיות ב-PBST בטמפרטורה של 4°C למשך מספר ימים לפני המעבר לשלב הבא.
2. הפשיט את הנוגדן הראשון
- מניחים את המגלשות בתמיסת נתרן ציטראט רותחת בנפח 275 מ"ל (10 מ"ל, pH = 6.0) למשך 8 דקות לפחות. השאירו את התמיסה רותחת על ידי הנחת המגלשות שטוחות בתחתית קופסת פיפטה בגודל 14 x 9.5 x 9 סמ"ק (רוחב x אורך x גובה) עם מכסה והנפה במיקרו של התמיסה בעוצמה של 70% בתנור מיקרוגל של 700 ואט למשך 8 דקות. אם מעדיפים זמן הפשטה ארוך יותר, ייתכן שיהיה צורך למלא את החיץ באמצעות תמיסת נתרן ציטראט רותחת כדי לשמור על המגלשות שקועות בתמיסת חיץ בכל עת. הוציאו את קופסת קצות הפיפט מהמיקרוגל, פתחו את המכסה ותנו לתמיסה להתקרר ב-RT למשך 20 דקות לפחות.
- מעבירים את המגלשות לצנצנת קופלין המכילה PBST. יש לשטוף עם PBST במשך 5 דקות 3x. אם השלב הבא לא מבוצע מיד, אחסנו את המגלשות בצנצנת קופלין עם PBST ב-RT למשך מספר שעות או בטמפרטורה של 4°C למשך 1-2 ימים.
3. כתם בנוגדן השני
- התחל משלב החסימה ובצע את אותם הליכים בשלב 1.5 עד 1.14. בשלבי פיתוח האות (שלב 1.15 ושלב 1.16), השתמש בפלואורופור-טירמיד בספקטרום פלואורסצנטי שונה.
הערה: ניתן להסיר שקופיות בשיטה זו מספר פעמים כדי לאפשר צביעה מרובה. הנוגדן האחרון אינו דורש פלואורופור-טירמיד כמו הכתב. נוגדן משני מצומד פלואורופור עשוי לשמש כדי להראות אותות מהנוגדן הראשוני האחרון.
- דגרו שקופיות עם 2 מיקרוגרם/מ"ל 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) או תמיסת Hoechst למשך דקה אחת ב-RT אם יש צורך בצביעת נגד גרעיני. לאחר מכן שטפו את המגלשות עם PBST במשך 3 דקות 2x.
