Method Article

שיטת Multiplex Immunostaining באמצעות נוגדנים ראשוניים מאותו מין פונדקאי

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Lyu, Q., et al. Microwaving ו- Fluorophore-Tyramide עבור Multiplex Immunostaining על אדרנלים של עכברים - באמצעות נוגדנים ראשוניים לא מצומדים מאותו מין מארח. J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מדגים בדיקה לביצוע multiplex immunostaining באמצעות נוגדנים ראשוניים מאותו מין מארח. בשיטה זו, מקטע רקמת יותרת הכליה עובר תהליך חיסוני דו-שלבי. בתחילה, החלק מוכתם בנוגדנים ספציפיים לסמנים בקליפת המוח, ולאחר מכן מפשיטים את הנוגדן הכבול ושומרים עם נוגדנים ספציפיים לסמנים במדולה.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. הכתמה בנוגדן הראשון

  1. שקופיות Dewax ו-rehydrate משובצות פרפין קבוע פורמלין (FFPE) עם 5 דקות מוקצות לכל אחד מהשלבים הבאים: קסילן או ריאגנטים שווי ערך 3x, 100% אתנול 2x, 95% אתנול 1x, 70% אתנול 1x, 50% אתנול 1x, ומים מזוקקים 2x.
    הערה: המגלשות צריכות להישאר לחות החל משלב זה של החזרת נוזלים ועד להרכבה בשלב האחרון.
  2. לשליפת אנטיגן אופציונלית, מקם את המגלשות בתמיסת נתרן ציטראט רותחת בנפח 275 מ"ל (10 mM, pH = 6.0) למשך 8 דקות. כדי לשמור על התמיסה רותחת, הניחו את המגלשות שטוחות בתחתית קופסת קצה פיפטה בגודל 14 x 9.5 x....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
אמצעי הרכבה נגד דהייהמעבדות וקטוריותH-1000
חמור Biotinylated נגד עכברג'קסוןאימונו715-066-151דילול 1:500
חמור ביוטינילציה נגד ארנבג'קסוןאימונו711-066-152דילול 1:500
דאפיביולג'נד4228012 מק"ג/מ"ל במים מזוקקים
מיקרוסקופ פלואורסצנטיהדסיבוב 4
סטרפטאבידין מצומד פרוקסידז חזרתג'קסוןאימונו016-030-084דילול 1:1000
תנור מיקרוגל, 700Wג'נרל אלקטריקJEM3072DH1BB
עכבר anti-CYP2F2סנטה קרוז,SC-374540דילול 1:250
עכבר אנטי-THסנטה קרוז,SC-25269דילול 1:1000
נסיוב חמורים רגילג'קסוןאימונו017-000-121סרום 2% ב-PBST
ארנב נגד 20αHSDקרפסט,EB4002דילול 1:500
ארנב נגד 3βHSDטרנסגני,KO607דילול 1:250
ארנב אנטי THנובוס,NB300-109דילול 1:1000
ארנב אנטי β-cateninאבקם,ab32572דילול 1:500
סטרפטווידין חזרת פרוקסידז (SA-HRP)ג'קסוןאימונו016-303-084דילול 1:1000
TSA Cy3 טירמידפרקיןאלמרSAT704B001EAדילול 1:100
TSA פלואורסצאין טירמידפרקיןאלמרSAT701001EAדילול 1:100

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplex ImmunostainingPrimary AntibodiesFluorophore TyramideAntibody StrippingAdrenal TissueCortex MedullaMicrowave Antigen RetrievalStreptavidin PeroxidaseNuclear StainingFluorescence Microscopy

Related Articles