מאמר שיטה

הדמיה אימונופלואורסצנטית מרובת משתתפים לניתוח תת-אוכלוסיות תאי T עמידים לאימונותרפיה

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Granier, C., et al. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים טכניקת הדמיה מולטיספקטרלית פלואורסצנטית באתרה לניתוח תת-אוכלוסיות שונות של תאי T חודרים ברקמת הגידול. קריוסקציה של רקמת קרצינומה של תאי הכליה מטופלת בנוגדנים כדי לתייג תאי T CD8+ המבטאים קולטנים מעכבים ספציפיים ומציגים פנוטיפ עמיד לאימונותרפיה. החלק המסומן מוצג באמצעות מיקרוסקופ מולטיספקטרלי כדי לזהות את תת-האוכלוסיות השונות של תאי CD8+ T.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון

1. באתרו אימונופלואורסנציה צביעה של לימפוציטים חודרי גידול (TILs)

  1. הנחיות פרוצדורליות
    1. בצע את כל שלבי הניסוי בטמפרטורת החדר.
    2. לכל השלבים, בצעו את הדילול בעזרת Tris Buffer Saline (TBS; ראו טבלת חומרים).
    3. בצע את השטיפה ב- TBS עבור כל השלבים למעט לאחר הדגירה הראשונית של הנוגדנים. עבור האחרון, השתמש Tris Buffer מלוחים Tween20 (TBST, ראה טבלה של חומרים). להרכב חיץ והרכבה מחדש, ראו טבלה 1.
    4. השתמשו בתא לחות לדגירת נוגדנים וצנצנת כתמים לשטיפה.
    5. אל תתנו לקטע להתייבש במהלך ההליך.
  2. טיפול מקדים
    1. הפשירו את השקף המכיל את דגימת הרקמה וייבשו בזהירות את המגלשה סביב הדגימה עם מגבת נייר. תחמו את אזור התגובה המכיל את הרקמה באמצעות עט מחסום הידרופובי (ראו טבלת חומרים). יבש במשך 2 דקות.
    2. מקבעים את הדגימות ב-100% אצטון למשך 5 דקות, מייבשים למשך 2 דקות ושוטפים עם כפות למשך 10 דקות.
  3. רוויה ומצור
    1. טפל בשקופיות במשך 10 דקות עם 3 טיפות של אבידין 0.1%, הקש ו / או החלק את השקף כדי לפזר את האבידין ולהסיר בועות אוויר, ולאחר מכן טפל במשך 10 דקות עם 3 טיפות ביוטין 0.01% (ראה טבלת חומרים), הקש ו / או פליק. יש לשטוף עם TBS.
    2. בצע חסימת קולטני Fc. יש למרוח 100 μL של נפח/נפח 5% של סרום רגיל מדולל ב-TBS. יש להשתמש בסרום מאותו מין מארח כמו הנוגדן המשני או השלישוני המסומן (ראו טבלת חומרים); כאן נעשה שימוש בסרום חמורים. דוגרים במשך 30 דקות.
    3. במהלך הדגירה, סובבו לזמן קצר את האנטי-CD8, תכנתו את חלבון המוות התא 1 (PD-1), ואת האימונוגלובולינים של תאי T ונוגדנים המכילים מוצין-3 (Tim-3) (טבלה של חומרים). הכינו את תמהיל הנוגדנים הראשוניים בשחפת כמתואר בטבלה 2.
  4. צביעה חיסונית עבור CD8, PD-1 ו- Tim-3
    1. הכינו את תערובת הנוגדנים העיקרית. עיין בטבלת החומרים ובטבלה 2 עבור הנוגדנים שבהם נעשה שימוש (anti-CD8, PD-1, Tim-3 והנוגדנים המשניים המתאימים להם) וריכוזיהם.
    2. הקש ו/או החלק את נסיוב החמור שנותר (נוסף בשלב 1.3.2). לדגור על שקופיות עם 100 μL של תערובת נוגדנים ראשוניים שאינם מסומנים במשך 1 שעה בתא לחות.
    3. במהלך הדגירה, סובבו בקצרה את נוגדני ציאנין 5 נגד ארנב, Alexa Fluor 488-anti-goat, ונוגדנים אנטי-עכבריים ביוטינילציה והכינו את תערובת הנוגדנים המשניים כמתואר בטבלה 2.
    4. שטפו את המגלשות ב-TBST במשך 5 דקות. יבשו את המגלשות.
    5. לדגור את שקופיות עם 100 μL של נוגדנים משניים במשך 30 דקות בתא לחות.
    6. הכינו את תערובת הנוגדנים השלישוניים המכילים ציאנין 3-סטרפטווידין, כמתואר בטבלה 2.
    7. שטפו את המגלשות ב-TBS במשך 10 דקות. יבשו את המגלשות.
    8. לדגור על שקופיות עם 100 μL של תערובת נוגדנים שלישוני במשך 30 דקות.
    9. שטפו את המגלשות ב-TBS במשך 10 דקות. יבשו את המגלשות.
  5. הרכבה על תאים
    1. הרכיבו את המגלשות באמצעי הרכבה 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) המכיל (1.5 מיקרוגרם/מ"ל DAPI) עם תלוש כיסוי תואם למיקרוסקופ פלואורסצנטי (ראה טבלת חומרים).
      הערה: כבקרה שלילית לכל ניסוי, נעשה שימוש בשקופית אחת עם נוגדנים תואמי איזוטיפ באותו ריכוז כמו הנוגדנים המתאימים. עבור צביעה זו השתמשנו בעכבר IgG1, ארנב IgG ונוגדני בקרה שליליים IgG של עיזים (ראו טבלת חומרים). כבקרה חיובית, השתמשנו בשקדים היפרפלסיים אנושיים, אשר ידועים כחיוביים עבור הסמנים שנבדקו, עבור כל ניסוי. מכתים טיפוסיים מתוארים בתוצאות (איור 1). צביעת מונו של CD8, PD-1 ו-Tim-3 צריכה להתבצע בנפרד (צביעה אחת בכל שקופית) עם אותו טיפול מקדים וללא DAPI. יש לבצע גם שקופית באותם תנאי ניסוי ללא כל נוגדן ורק אמצעי הרכבה DAPI. יש לצלם שקופית בתנאי ניסוי זהים ללא כל נוגדן וללא DAPI.

2. ניתוח פלואורסצנטי וספירת תאים אוטומטית

  1. רכישת תמונה באמצעות המיקרוסקופ האוטומטי
    1. צור פרוטוקול.
      1. הפעל את תוכנת המיקרוסקופ האוטומטי ואת התאורה הפלואורסצנטית.
      2. בשורת התפריטים, לחץ על "קובץ", "צור פרוטוקול", בחר "DAPI", "FITC" ו- "TRITC".
      3. לחץ על "הבא", "מקטע רקמות" ולחץ על "הבא", "שם פרוטוקול". בחר שם, לדוגמה, "CD8-PD-1-Tim-3", לחץ על "הבא" ועל "שמור".
      4. מקם ידנית שקופית על הבמה.
      5. בשורת התפריטים, לחץ על "הגדרה" ועל "הגדרות". לחץ על "הגדר בית Z" בחלון החדש.
      6. התאם את זמן החשיפה באמצעות שקופית בקרה חיובית, כלומר CD8, PD-1 ו-Tim-3 המוכתמים משולשת באמצעות דגימת DAPI.
      7. בסרגל הבקרה, לחץ על "הגדר חשיפה".
      8. התאימו את זמן החשיפה לכל מסנן עד לקבלת אות מספיק אך לא רווי
        9. .
      9. עבור הדמיה מונוכרום, בצע את הפעולות הבאות:
      10. בחר רכישה, ותחת 'מיקוד אוטומטי', בחר את מסנן DAPI.
      11. ב"מגבלת אזור הסריקה", הזז את המטרה העליונה לפינה השמאלית העליונה של השקופית. לחץ על "סימן". בצע את אותו הדבר עבור הפינה השמאלית התחתונה.
        הערה: שלב זה תוחם את האזור של הדמיה בהספק נמוך (הדמיית LP) ב- 4X; הקפד למקם את הסימן היטב כדי להקיף את כל דוגמאות הסדרה.
      12. עבור הדמיה בהספק גבוה (HP), בצע את הפעולות הבאות:
      13. תחת 'מיקוד אוטומטי', בחר 'DAPI'.
      14. תחת רצועת 'רכישה', בחר "DAPI", "FITC", "Cy3" ו- "Cy5". לחץ על "אישור". לחץ על "קובץ" ו "שמור פרוטוקול" בשורת התפריטים.
    2. סרוק את השקופיות.
      1. טען את הפרוטוקול על ידי לחיצה על "קובץ" ו "טען פרוטוקול" משורת התפריטים. לחץ על "התחל".
      2. הזן 'מזהה מעבדה' (מיקום תיקיה לאחסון תמונות). הזן מזהה שקופית כדי לזהות את השקופית. לחץ על "הבא".
      3. לחץ על "Monochrome Imaging" (כדי לסרוק את כל השקופית תחת תאורת שדה בהירה ולקבל תמונות רציפות באמצעות מטרה 4x).
        הערה: פעולה זו מפיקה סקירה בגווני אפור של השקופית.
      4. לחץ על "מצא דגימה". בחרו את אזור הרקמה לסריקה ברזולוציה נמוכה (4x): החזיקו את מקש Ctrl ולחצו על שדה באמצעות הסמן כדי לבחור או לבטל את הבחירה בשדות (איור 2A).
      5. לחץ על "LP Imaging" (4x imaging) לקבלת תמונה פלואורסצנטית בצבע אדום, כחול, ירוק של כל שדה.
      6. לבחירת שדה HP, החזק את מקש Ctrl לחוץ ולחץ על שדה באמצעות הסמן כדי לבחור או לבטל את הבחירה בשדות המתאימים לאזור הרקמה שייסרקו ברזולוציה גבוהה (20x). בחר 5 שדות (איור 2B).
      7. לחץ על "HP Imaging" (הדמיה של 20x) לקבלת רכישת תמונה מולטיספקטרלית של כל שדה (איור 2C).
      8. לחץ על "אחסון נתונים" כדי לאחסן תמונות בתיקייה שנבחרה בהתחלה ב- LabID.
        הערה: התהליך מסוכם ומודגם באיור 2. עבור כל שלב (זיהוי רקמות, בחירת שדה), המשתמש יכול להגדיל את האלגוריתם ולאמן אותו לתהליך סריקה אוטומטי שלם.

טבלה 1: הרכב חיץ של TBS ו-TBST. TBS משמש לתערובות ודילול נוגדנים. עבור שטיפות, כל השלבים מבוצעים עם TBS למעט השטיפות בעקבות נוגדנים ראשוניים, שם TBST מומלץ.

טב"סTBST
Tris-HCl0.05 מטר0.05 מטר
NaCl0.15 מטר0.15 מטר
טווין 20-0.05%
pH7.67.6
הכנה1 טבליה ב- 500 מ"ל H2O

טבלה 2: הרכב תערובת נוגדנים מפורט עבור צביעת CD8-PD-1-Tim-3 immunofluorescence. עבור כל תערובות נוגדנים ראשוניים, משניים ושלישוניים, הדילול לביצוע בנפח המתאים של TBS ניתן עבור נפח כולל של 1 מ"ל. עבור שקופית אחת, נפח התגובה הכולל הוא 100 μL עבור שטח רקמה של 2 ס"מ2.

נפח הנוגדן הראשוניV סופי = 1 מ"ל
ארנב נגד CD8עכבר נגד PD-1עז נגד טים-3טב"ס
1.6 מיקרוליטר2 μL30 מיקרוליטר966.4 מיקרוליטר
נפח הנוגדן המשני
ציאן 5 נגד ארנבאנטי-עכבר ביוטינילציהAlexa Fluor 488 נגד עזיםטב"ס
3.3 מיקרוליטר2 μL2.5 מיקרוליטר992.2
נפח הנוגדנים השלישוניים
Cy3 שכותרתו סטרפטאבידיןטב"ס
3.3 מיקרוליטר996.7

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
איור 1: CD8-PD-1-Tim-3 immunostaining על רקמה משובצת פרפין שקדים. נבחרו מקטעי רקמה משובצים פרפין במקום מקטעים שמורים בהקפאה עבור צביעה חיסונית משולשת. לאחר הסרת שעווה והתייבשות, יושם אותו פרוטוקול של צביעה שפותח בעבר עבור חלקים שמורים בהקפאה. תאי T CD8+ ממוקמים מחוץ למרכז הנבט, ותאי T שאינם CD8+ המבטאים PD-1 מקובצים במרכז הנבט. הגדלת המיקרוסקופ היא פי 20, וסרגל קנה המידה מייצג 20 מיקרומטר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Vectra 3 הדמיה פתולוגית כמותית אוטומטיתפרקין אלמרCLS142338
ניתוח תאי inForm 2.1.פרקין אלמרCLS135781
תוכנת Rhttps://www.r-project.org
עט תיחום DakopenדקוS2002
Tris Buffer מלוחים טבליות TBSTakara, ביו בע"מTAKT9141ZpH7.6 100 טבליה
Tris Buffer טווין מי מלח 20 TBS (+Tween20)Takara, ביו בע"מTAKT9142ZpH 7.6 100 טבליות
מערכת חסימת ביוטיןדקוX0590אבידין 0.1% וביוטין 0.01%
נסיוב חמורים רגילג'קסון אימונוריסרץ'017-000-001ריכוז 5% כרך/נפח
Fluoroshield עם DAPIסיגמא-אולדריץ'F6057ריכוז של 1.5 מק"ג/מ"ל
חיפוי זכוכית סריגKnittel Gläser,10003924x60 מ"מ 100 החלקות כיסוי
ארנב נגד CD8 Clone P17-VנובוסNBP1-79055יש להשתמש במהירות של 4 מיקרוגרם/מ"ל
עכבר נגד PD-1 שיבוט NATABCAMAB52587יש להשתמש בכמות של 2 מיקרוגרם/מ"ל
עז נגד טים-3מו"פAF2365לשימוש בכמות של 3 מק"ג/מ"ל
ארנב נגד PD-L1 שיבוט SP142רוש7309457001יש להשתמש בכמות של 1 מיקרוגרם/מ"ל
עכבר AF647 מסומן pan- קרטין Clone C11איתות סלולרי4528יש להשתמש במינון של 0.5 מיקרוגרם/מ"ל
גל אנטי-אנושי עז9מו"פAF2045יש להשתמש במינון של 0.3 מיקרוגרם/מ"ל
ציאן 5 חמור מצומד נגד ארנבג'קסון אימונוריסרץ'711-175-152לשימוש במינון של 5 מיקרוגרם/מ"ל
חמור ביוטינילציה F(ab'2) נגד עכבר IgGג'קסון אימונוריסרץ'715-066-150לשימוש בכמות של 3 מק"ג/מ"ל
Alexa Fluor488 חמור מצומד נגד עז IgGABCAMab150133לשימוש במינון של 5 מיקרוגרם/מ"ל
Cy3 שכותרתו סטרפטאבידיןאמרשםPA43001לשימוש בכמות של 3 מק"ג/מ"ל
עכבר שליטה שלילית IgG1דקוX0931יש להשתמש בכמות של 2 מיקרוגרם/מ"ל
IgG מסרום עיזיםסיגמא-אולדריץ'I5256לשימוש בכמות של 3 מק"ג/מ"ל
IgG מסרום ארנבסיגמא-אולדריץ'I5006יש להשתמש במהירות של 4 מיקרוגרם/מ"ל

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

TT CD8PD 1Tim 3

מאמרים קשורים