טכניקת אימונופלואורסנציה ללוקליזציה של חלבונים נגיפיים בתאים נגועים

תקציר

מקור: Samrat, S. K. et al., ניתוח זמני של טרנסלוקציה גרעינית לציטופלזמית של חלבון וירוס הרפס סימפלקס 1 על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי אימונופלואורסצנטי.J. Vis. Exp.(2018)

סרטון זה מדגים שיטה לניטור חלבון תא נגוע 0, ICP0 סחר בזיהום הרפס סימפלקס-1. לאחר סינתזת נובו, ICP0 עובר טרנסלוקציה לגרעין, ומאוחר יותר עובר לציטופלסמה במהלך התקדמות הזיהום. מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי חושף ומנתח את הלוקליזציה התת-תאית של החלבון, ומציע תובנות לגבי הסחר שלו לאורך שלבי זיהום.

פרוטוקול

1. זריעת תאים והדבקה בנגיף

1. ב 20-24 שעות לפני זיהום הנגיף, זרע 5 x 10⁴ של ריאות עובריות אנושיות (HEL) תאים פיברובלסטים או תאים אחרים להיבדק על 4-באר 11 מ"מ staggered slide במדיום צמיחה (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS)). לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% פחמן דו חמצני (CO₂).
   הערה: כל באר צריכה להיות 70-80% מפגש תאים בזמן ההדבקה.
2. למחרת, הסירו את מדיום הגידול והדביקו את התאים בנגיפים במדיום-199 בטווח של 4-10 pfu/cell. לדגור על תאים נגועים בנגיף למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37°C. המשיכו לנער את המגלשה במהלך תקופת הדגירה.
3. לאחר הדגירה של 1 שעות, יש להסיר את Medium-199 ולהשלים עם growth medium.
   הערה: ניתן להוסיף תרופות המפריעות לשלבי זיהום שונים בשלב זה או לפני ספיגת הנגיף.
4. לדגור על התאים הנגועים בנגיף ב 37 ° C עם 5% CO₂ לפרקי זמן שונים של תקופת ההדבקה.

2. קיבוע וחלחול

1. בזמן ההדבקה המתאים, שטפו במהירות את התאים הנגועים במי מלח חוצצי פוספט (PBS) 3 פעמים והוסיפו 200 μL של 4% פרפורמלדהיד טרי שהוכן ב-PBS. דוגרים על התאים עם פרפורמלדהיד במשך 8-10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקבע את התאים בכל באר.
2. שואפים paraformaldehyde ולשטוף את הבארות עם 200 μL של PBS במשך 3 פעמים. לגמרי לשאוף PBS לאחר כביסה³
.
3. הוסף 100 μL של 0.2% פעילי שטח לא יוניים לכל באר כדי לחדור את התאים במשך 5-10 דקות.
4. שאפו את חומר פעילי השטח הלא יוני ושטפו את הבארות עם 200 μL של PBS במשך 3 פעמים.

3. צביעה אימונופלואורסצנטית

יש
1. לשאוף לחלוטין ל-PBS ולהוסיף 200 מיקרוליטר של חיץ חוסם (אלבומין בסרום בקר 1% (BSA) וסרום סוסים 5% ב-PBS) בכל באר ולדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת או ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
2. הוסף ריכוז שנקבע בניסוי של נוגדן ראשוני כנגד חלבון תא נגוע 0 (נוגדן רב-שבטי נגד ICP0) בחיץ חוסם ודגור על נוגדן ראשוני בטמפרטורת החדר למשך שעתיים או ב -4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
3. יש לשטוף עם חיץ חוסם 3 פעמים עם דגירה של 10 דקות. הוסיפו נוגדן משני נגד ארנב עז מצומד Alexa 594 (1:400 מדולל בחיץ חוסם) ודגרו על המגלשות בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן שטפו את המגלשות 3 פעמים עם מאגר חוסם במרווחים של 10 דקות.
4. לבסוף, שטפו את המגלשה פעם אחת עם PBS כדי להסיר שאריות BSA וסרום סוסים.
5. הוסף טיפה אחת של אמצעי הרכבה נגד דהייה עם 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) כדי להרכיב את המגלשה ולאטום אותה עם כיסוי באמצעות לק שקוף.

4. הדמיה קונפוקלית

1. בעזרת מיקרוסקופ קונפוקלי, הגדר את אורך הגל ל-590-650 ננומטר עבור Alexa 594 ו-410-520 ננומטר עבור DAPI. בחר תבנית תמונה ברזולוציה של 1024 x 1024 וממוצע קו של 8 כדי לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה.
2. נתחו כל באר בשקופית 4 בארות תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. קבל תמונות תאים מייצגות תחת המטרה 100X, כפי שמוצג באיור 1 ובאיור 2.
3. לספירת מספר גדול של תאים, צלם תמונות של שדות עוקבים תחת המטרה 40X.
   הערה: זה דורש 5-10 תמונות כדי לצבור מעל 200 תאים נגועים מכל נקודת זמן של כל זיהום.
4. בכל ניסוי, צלם תמונות עם פרמטרים קונפוקליים קבועים עבור כל הדגימות שיש להשוות.

5. ניתוח התפלגות גרעינית לעומת ציטופלזמית

1. פרויקט פתוח עם תוכנת היישום confocal. בחר תמונה שממנה תאים צריכים להיות טבולים עבור התפלגות גרעינית לעומת ציטופלזמית של ICP0.
2. לחץ על הכרטיסייה "כמות" מהתפריט העליון ובחר "מיין ROIs" מתפריט כלים.
3. צייר קו אורך על פני התא לניתוח על ידי בחירת "צייר קו" מהתפריט העליון.
   הערה: היסטוגרמה תופיע המראה את עוצמת הפלואורסצנטיות לאורך הקו הן עבור ICP0 והן עבור DAPI. בהיסטוגרמה, הקו הכחול מייצג פיקסלים של DAPI ומסמן את גבול הגרעין ואילו הקו האדום מייצג פיקסלים מסוג ICP0.
4. בהתבסס על צביעת רקע, הגדר סף קבוע לעוצמת ICP0 כדי לנתח את ההתפלגות התת-תאית של ICP0 בכל ניסוי.
   1. כפי שמודגם באיור 2, אם האות האדום בממוצע נמצא מתחת לסף באזור הגרעין, אך נמצא מעל הסף שמעבר לגבול הכחול, סווג את האות האדום כממוקם בעיקר בציטופלסמה.
   2. אם האות האדום נמצא מעל הסף בכל הגרעין ומעבר לגבול האות הכחול, קבץ את האות האדום כגרעין בתוספת לוקליזציה ציטופלזמית.
   3. אם האות האדום נמצא מעל הסף בגרעין אך בממוצע נמצא מתחתיו מחוץ לגבול האות הכחול, קבץ את האות האדום כלוקליזציה גרעינית.
5. ערכו טבלה של יותר מ-200 תאים נגועים מכל דגימה בזמן הדבקה שונה, והתוו בגרף עמודות כדי להמחיש את תנועת ICP0 לפי זמן (איור 3).

תוצאות

איור 1: סחר דינמי של ICP0 במהלך זיהום HSV-1.תאי HEL שגדלו על שקופיות 4 בארות היו נגועים באבטיפוס HSV-1 (זן F) ב 10 pfu/cell. לאחר 1, 5 ו-9 שעות לאחר ההדבקה (hpi), התאים תוקנו, חלחלו והגיבו לנוגדנים ראשוניים נגד ICP0 של ארנבים ועכברים נגד PML, ולאחר מכן הגיבו לנוגדנים משניים מצומדים נגד ארנבים של Alexa 594 ונוגדנים משניים מצומדים של Alexa 488 נגד עכברים לצורך הדמיה תחת מטרות של 100X. חלבון לוקמיה פרומ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תאים ווירוסים
פיברובלסטים ריאתיים עובריים אנושיים (תאי HEL)	ד"ר תומאס שנק (אונ' פרינסטון)		תאי HEL גודלו ב-DMEM בתוספת 10% FBS
HSV-1 ויראלי סטוק (זן F)	מעבדת ד"ר ברנרד רויזמן
בינוני
מדיום הנשר השונה של דולבקו (DMEM)	Invitrogen	11965-092
סרום בקר עוברי (FBS)	סיגמא	F0926-500 מ"ל
בינוני-199 (פי 10)	גיבקו	11825-015
ריאגנטים
4 - באר 11 מ"מ מגלשה מדורגת	Cel-Line/Thermofisher Scientific	30-149H-שחור
16% תמיסת פרפורמאלדהיד(ללא מתנול)	תרמו סיינטיפיק	28908
טריטון X-100	ריאגנטים של פישר	BP151-1C0
אבומין בסרום בקר (BSA)	קלביוכם	CAS 9048-46-8
סרום סוסים	סיגמא	H1270
מלח חוצץ פוספט (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4)	מעבדת ד"ר היידונג גו
NaCl	פישר ביוריאגנט	BP358-212
KH2PO4	פישר ביוריאגנט	BP362-500
KCl	פישר סיינטיפיק	BP366-500
Na2HPO4	פישר ביוריאגנט	BP332-500
חיץ חוסם (PBS עם 1% BSA ו-5% נסיוב סוסים)	מעבדת ד"ר היידונג גו
נוגדן Rabiit Anti-ICP0	מעבדת ד"ר היידונג גו
PML (PG-M3)-עכבר חד-שבטי IgG	סנטה קרוז ביוטכנולוגיה	SC-966
Alexa Fluor 594-עז נגד ארנב IgG	Invitrogen	A11012
Alexa Fluor 488-עז נגד עכבר IgG	Invitrogen	A11001
Vectashield Mouting בינוני עם DAPI	מעבדות וקטוריות	H-1200
פיפטה פסטר	פישר ברנד	13-678-20ד
לק	סאלי הנסן
ציוד
מיקרוסקופ קונפוקלי	Leica SP8
תוכנת קונפוקל	חבילת היישומים Leica LAS X
תוכנת Excel	מיקרוסופט אקסל
חממת HERAcell 150i CO2	תרמו סיינטיפיק	קוד הזמנה 51026282