כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.
1. כריתה כירורגית והכנת רקמות
- המתת חסד של העכבר על ידי הזרקה תוך-צפקית של 1 מ"ל של טריברומו-אתנול (מוכן על פי פרוטוקול סטנדרטי; טבלת חומרים).
הערה: יש להימנע מחנקCO2 במחקרי ריאות מכיוון שהוא עלול לגרום לפגיעה ריאתית ולשנות את התכונות והתכונות של תאי חיסון ריאות. יש להימנע גם מפריקת צוואר הרחם מכיוון שהיא עלולה לגרום לפגיעה מכנית של הריאה.
- העבר את העכבר לאזור נקי וייעודי לפעולה כירורגית.
- ייצב את הצד הגבי של העכבר כלפי מטה באמצעות מחטים או סרט על ארבע הגפיים. השתמש ב-70% אתנול כדי לחטא את עור אזור הגחון.
- לבצע חתך בעור, מהצוואר ועד הבטן. הסר בזהירות את העור מאזור בית החזה.
- הסר בזהירות את עצם החזה והצלעות.
- שטפו את הריאות על ידי הזרקת 10 מ"ל של מי מלח קרים עם חוצץ פוספט (PBS) ישירות לחדר הימני, באמצעות מחט 18-21 גרם, עד שהריאות הופכות לבנות לחלוטין.
- הסר בזהירות את בלוטת התימוס והלב מבלי לגעת בריאות.
- נתק בעדינות את הריאות מהרקמות שמסביב והעביר אותן לצינור עם מאגר אלבומין בסרום בקר קר (BSA) (טבלה 1).
הערה: יש לעשות מאמץ להסיר את כל השומן הסמוך מהריאות לפני הכנה נוספת של התרחיף החד-תאי, מכיוון שהדבר עלול להטות את הקריאות.
2. הכנת תרחיף חד-תאי
- מעבירים את הריאות לצלחת פטרי ריקה וטוחנים אותן בשני אזמלים עדינים. מעבירים את כל חתיכות הריאה הטחונה לצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל. השתמש ב-5 מ"ל של מאגר עיכול כדי לשטוף את הצלחת ולהוסיף אותה לצינור של 50 מ"ל המכיל את הריאה הטחונה (טבלה 1).
הערה: יש להכין מאגר עיכול מיד לפני השימוש. יש להשתמש ב-5 מ"ג/מ"ל של קולגנאז. שילוב של 1 או 5 מ"ג קולגנאז עם בופר BSA או PBS נטול חלבון לא שיפר את התוצאות (איור 1).
- אבטח את מכסה הצינור ועכל את הריאה למשך 30 דקות על שייקר אורביטלי במהירות של 150 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס. עצור את התגובה על ידי הוספת 10 מ"ל של מאגר BSA קר.
- לאחר העיכול, השתמש במחט של 18 גרם כדי לערבב ולהמיס את חתיכות הריאה. הנח מסננת פילטר של 70 מיקרומטר בחלק העליון של צינור חרוטי חדש של 50 מ"ל.
הערה: שימוש במסנן מיקרון קטן יותר עלול לגרום לאובדן אוכלוסיות מיאלואידיות עיקריות.
- העבירו לאט את תערובת הריאות המעוכלת ישירות על המסננת. השתמש בצד הגומי של בוכנת מזרק של 10 מ"ל כדי לרסק את חלקי הריאה הנותרים על המסנן. שוטפים את החומר המעובד על המסנן עם מאגר BSA.
- צנטריפוגה את המתלה החד-תאי ב-350 × גרם למשך 8 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
- השליכו בזהירות את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-1 מ"ל של מאגר ליזה אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK). מערבבים היטב בעזרת פיפט של 1 מ"ל, ודוגרים במשך 90 שניות בטמפרטורת החדר.
- הוסף 10 מ"ל של מאגר BSA קר כדי לעצור את התגובה והצנטריפוגה ב-350 × גרם למשך 7 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.השליכו בזהירות את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה במאגר הצביעה כדי לספור את התאים באמצעות המוציטומטר.
- השעו מחדש את התאים בריכוז של 5 × 106 תאים/מ"ל והשתמשו בהם לצביעה על פני השטח (ראה סעיף 2).
הערה: למטרה זו, צלחו את התאים בצלחת תחתונה עגולה של 96 בארות ואחריה צביעת נוגדנים ושטיפות. אם צנטריפוגת צלחת אינה זמינה, השתמש בצינורות זרימה במקום צלחות. בעזרת פרוטוקול זה, ניתן להשיג ~15-20 ×-106 תאים לריאה מעכבר C57BL/6 בן 6-10 שבועות בגודל ממוצע.
3. צביעת נוגדנים על פני השטח
- העבירו 1 × 106 תאים ב -200 מיקרוליטר לבאר בצלחת של 96 בארות. צנטריפוגה את הצלחת בחום של 350 × גרם למשך 7 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. בינתיים, הכינו את תמיסת חסימת ה-Fc על ידי דילול נוגדן אנטי-16/32 (1:100) במאגר צביעה (טבלה 1).
- השעו מחדש את התאים ב-50 מיקרוליטר של תמיסת חסימת FC שהוכנה מראש (טבלת החומרים) ודגרו למשך 15-20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס או על קרח.
- הוסף 150 מיקרוליטר של מאגר מכתים וצנטריפוגה את הצלחת ב-350 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. בינתיים, הכינו את קוקטייל הנוגדנים על פני השטח על ידי דילול נוגדנים על פני השטח (1:100; טבלה 2) במאגר מכתים.
הערה: (i) ניתן להשתמש בנוגדנים נגד 16/32 לחסימת FC עם נוגדנים פני השטח באותה תערובת. (ii) אם נעשה שימוש בצבע כדאיות הניתן לתיקון, הוסף אותו לקוקטייל הנוגדנים על פני השטח בדילול של 1:1,000.
- השעו מחדש את התאים ב-50 מיקרוליטר מקוקטייל הנוגדנים המוכן מראש על פני השטח ודגרו למשך 30-40 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך. שוטפים את התאים עם מאגר מכתים פעמיים.
הערה: אם אין צורך בצביעה תוך-תאית, השעו מחדש את התאים ב-200 מיקרוליטר של מאגר צביעה והמשיכו ישירות לרכישת נתונים על ציטומטר הזרימה. לחלופין, תאים עשויים להיות קבועים ומאוחסנים ב-4 מעלות צלזיוס לרכישה מאוחר יותר. אנו ממליצים להשתמש בתאים לזרימה ציטומטרית תוך 24 שעות.
4. קיבוע תאים וצביעה תוך תאית
- הכן את מאגר הקיבוע/חדירות (Fix/Perm Buffer) על ידי ערבוב שלושה חלקים של תרכיז קיבוע/חדירות וחלק אחד של מדלל קיבוע/חדירות של ערכת מאגר צביעת FoxP3/Transcription Factor (טבלה 1).
- השעו מחדש את התאים ב-50 מיקרוליטר של מאגר ה-Fix/Perm שהוכן מראש לכל באר של צלחת 96 הבארות, שם צופו התאים כמתואר בסעיף 3, ודגרו אותם למשך 20-25 דקות ב-4 מעלות צלזיוס בחושך.
- מדללים את מאגר החדירות פי 10 כ-1: 10 במים דה-יונים מטוהרים להכנת מאגר חדירות פי 1.
- שטפו את התאים פעם אחת עם מאגר חדירות פי 1. בינתיים, הכינו את קוקטייל הנוגדנים התוך תאיים על ידי דילול נוגדנים תוך תאיים (1:100) ב-1 מ"ל של מאגר חדירה.
- השעו מחדש את התאים באמצעות 50 מיקרוליטר מקוקטייל הנוגדנים המוכן מראש לכל תא של צלחת 96 הבארות ודגרו למשך 40 דקות ב-4 מעלות צלזיוס בחושך.
- שטפו את התאים פעם אחת עם מאגר חדירות ופעם אחת עם מאגר מכתים. לאחר הכביסה הסופית, השעו מחדש את התאים ב -200 מיקרוליטר של מאגר מכתים.< />
הערה: אם אין ציטומטר זרימה עם קורא צלחות, העבר את התאים לצינורות ציטומטריית זרימה.
- רכוש מינימום של 1.5 × 106 תאים לדגימה בציטומטר הזרימה.
הערה: עבור צבעים בודדים ודגימות בקרה לא מוכתמות, 0.5-1 × 106 תאים לדגימה יספיקו. מומלץ לטיטר את הנוגדנים הבודדים המשמשים להשגת צביעה אופטימלית ולהפחתת עלויות. הפרוטוקול הנוכחי עבר אופטימיזציה באמצעות Fix/Perm Buffer שהוכן באמצעות ערכת מאגר הצביעה FoxP3. מכיוון ש-CD68 הוא ציטופלזמי ולא סמן גרעיני, פתרונות חדירה אחרים כגון ריכוז נמוך של פרפורמלדהיד או ערכות ציטופיקס/ציטופרם מספקים שונים עשויים להספיק.
טבלה 1: מאגרים.
| מאגר BSA | PBS + 0.5% אלבומין סרום בקר |
| מאגר עיכול | חוצץ BSA מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) + 5 מ"ג/מ"ל קולגנאז סוג 1 + 0.2 מ"ג/מ"ל DNase I |
| מאגר מכתים | PBS + 2.5% FBS |
| מאגר תיקון/סלסול | שלושה חלקים של מדלל קיבוע/פרמביליזציה וחלק אחד של מדלל קיבוע/חדירות של ערכת מאגר צביעה של Foxp3/Transcription Factor |
| מאגר פרמיביליזציה | מאגר חדירות פי 10 מסט מאגר הצביעה של Foxp3/Transcription Factor מדולל 10 פעמים במים מטוהרים דה-יונים |
טבלה 2: שימוש בנוגדנים חד-שבטיים.
| אנטיגן | שיבוט | פלואורוכרום | דילול | משטח/תוך-תאי |
| CD45 | 30-ו11 | APC/CY7 | 1:100 | משטח |
| גר-1 | RB6-8C5 | רי"ב421 | 1:100 | משטח |
| CD68 | FA-11 | PerCPCy5.5 | 1:100 | תאיים |
| CD11b | M1/70 | PECy7 | 1:100 | משטח |
| סיגלץ פ | S17007L | פיטק | 1:100 | משטח |
| CD11c | N418 | BV650 או BV510 | 1:100 | משטח |
| CD64 | X54-5/7.1 | PE/סנוור 594 | 1:100 | משטח |
| MHC-II | M5/114.15.2 | AF700 | 1:100 | משטח |
| תקליטור 103 | 2.00ה+07 | PE / FITC | 1:100 | משטח |
| חי/מת ניתן לתיקון לקריאה רחוקה ערכת כתמי תאים מתים | | FarRed (APC) או אקווה (BV510) | 1:1000 | משטח |
| תקליטור 3 | 17א2 | PE | 1:100 | משטח |
| ב220 | RA3-6B2 | AF488 | 1:100 | משטח |
| NK1.1 | PK136 | פיטק | 1:100 | משטח |
| תקליטור 24 | 30-F1 | PE | 1:100 | משטח |
| מרטק | 2B10C42 | PE | 1:100 | משטח |
| F4/80 | BM8 | BV605 | 1:100 | משטח |
| CX3CR1 | SA011F11 | PE | 1:100 | משטח |
| FcBlock (CD16/32) | 93 | | 1:100 | משטח |
