מדידת יעילות פאגוציטית של מקרופאגים באמצעות פרימקווין וטיפול פוטודינמי

תקציר

הסרטון מדגים את הערכת השפעת הטיפול הפוטודינמי על יעילות הפאגוציטים של מקרופאגים מורין עם פרימקין. מקרופאגים מטופלים ונגועים מייצרים מיני חמצן תגובתיים, מה שמוביל למוות פטרייתי סלקטיבי, המתבטא במושבות מצומצמות על הצלחת.

פרוטוקול

1. הכנת תאים קריפטוקוקליים

1. פזרו את אורגניזם הבדיקה עם לולאת חיסון על צלחת אגר סטרילית של תמצית שמרים-לתת (YM).
2. דוגרים על צלחת האגר בטמפרטורה של 30°C למשך 48 שעות.
3. השתמש בלולאת חיסון כדי לגרוף 5 מושבות בודדות ולהשהות אותן ב 5 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים.
4. תקנן את התאים באמצעות תקן McFarland כדי להשיג ריכוז תאים בין 0.5 × 10,⁵ ו 2.5 × 10,⁵ יחידות יוצרות מושבה (CFU) לכל מ"ל של RPMI-1640 בינוני.
5. יש לפזר תרחיף של 100 μL לבארות של לוחות מיקרוטיטר המכילים מקרופאגים מזרעים (ראו סעיף להלן).

2. הכנת מקרופאגים

1. יש לטפח קו תאי מקרופאג מורין, RAW 264.7, על בקבוק רקמה המכיל 10 מ"ל של RPMI-1640 בינוני, בתוספת סטרפטומיצין 20 מ"ג/מ"ל, 2 מ"מ L-גלוטמין, 20 U/mL פניצילין וסרום בקר עוברי 10%.
2. הניחו את הבקבוק באינקובטור של 5%_CO2 בטמפרטורה של 37°C עד להשגת מפגש של 80%.
3. גרדו בעדינות את התאים באמצעות מגרד תאים.
4. מעבירים את התאים המרחפים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
5. השתמש בכתם הכחול trypan כדי לקבוע את כדאיות התא.
   הערה: עדיף ציון כדאיות מעל 85%.
6. השתמש בהמוציטומטר כדי להתאים את ריכוז התאים של המקרופאגים ל- 1 × 10⁶ תאים/מ"ל באמצעות תמיסה של 10 מ"ל של מדיום RPMI-1640 טרי וסטרילי.
7. מחלקים תרחיף של 100 μL של תאים לתוך בארות של צלחת מיקרוטיטר סטרילית בעלת 96 בארות שטוחות.
8. יש לדגור על הצלחת למשך הלילה באינקובטור של 5% CO₂ בטמפרטורה של 37°C.
   הערה: לפני השימוש, יש לשאוף את המדיה ללילה ולהחליף אותה ב-100 μL של מדיה טרייה וסטרילית של Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640).

3. הכנת המתחם

1. יש להמיס פוטונסיטייזרים ופרימקין (PQ) במים מזוקקים להכנת תמיסת מלאי.
2. לדלל את התרכובת עוד יותר במדיה RPMI-1640.
   הערה: הכמות הסופית של מים מזוקקים במדיה RPMI-1640 לא תעלה על 1%.
3. יש לפזר תמיסה של 100 מיקרוליטר של הפוטוסנסיטיזר המוכן כדי לרבע את הריכוז הרצוי לבארות מתאימות המכילות את המקרופאגים ותאי הקריפטוקוק שכבר נזרעו.

4. יישום טיפול פוטודינמי (PDT)

1. הגדר את תנאי הניסוי הבאים:
   1. תאים בתרבית משותפת עם 0 מיקרומטר של PQ וחשופים לאור כהה (DL) למשך 2 דקות (כלומר, תאים לא מטופלים (שאינם Rx)
   2. תאים בתרבית משותפת עם 6 מיקרומטר ונחשפו ל-DL למשך 2 דקות (כלומר, אפקט התרופה)
   3. תאים בתרבית משותפת 15 מיקרומטר של PQ ונחשפו ל-DL במשך 2 דקות (כלומר, אפקט התרופה)
   4. תאים בתרבית משותפת עם 30 מיקרומטר של PQ ונחשפו ל-DL למשך 2 דקות (כלומר, אפקט התרופה)
   5. תאים בתרבית משותפת עם 0 מיקרומטר של PQ וחשופים לאולטרה סגול (UV) למשך 2 דקות (אפקט UV)
   6. תאים בתרבית משותפת עם 6 מיקרומטר של PQ וחשופים לאור אולטרה סגול (UVL) במשך 2 דקות (כלומר, אפקט PDT)
   7. תאים בתרבית משותפת עם 15 מיקרומטר של PQ וחשופים לקרינת UVL למשך 2 דקות (כלומר, אפקט PDT)
   8. תאים בתרבית משותפת עם 30 מיקרומטר של PQ ונחשפו ל- UVL למשך 2 דקות (כלומר, אפקט PDT)
      הערה: יש לאפשר לתאים שעברו תרבית משותפת להגיב עם PQ במשך 30 דקות בחושך (היכן שרלוונטי), לפני חשיפה לקרינת UVL (היכן שרלוונטי).
      הערה: בעבודה הנוכחית קבענו של-PQ יש ספיגת UV/Vis של 260 ננומטר, שהיא בתחום ה-UV של המנורה החיידקית. בשל האחרון, השתמשנו במנורת UVC (Ultraviolet C) חיידקית המותקנת בארון בטיחות ביולוגי Class II כמקור אור ליישום PDT. המנורה מדווחת כבעלת הספק נומינלי של 30 וואט. התאים נשמרו במרחק של כ-20 ס"מ מהמנורה במחקר הנוכחי. במרחק זה, המנורה מוערכת בתפוקת קרינה של 625 μW / cm².

5. ספירת מושבות כדי לקבוע את הישרדותם של תאים קריפטוקוקליים

1. לאחר התחלת טיפול פוטודינמי בתאים שעברו תרבית משותפת כפי שצוין לעיל, יש לדגור על הלוחות בטמפרטורה של 37°C ב-5%_CO2 למשך 18 שעות.
2. לאחר 18 שעות, שאפו את הסופרנטנט.
3. שטפו את הבארות עם 200 מיקרוליטר של תמיסת חיץ פוספט (PBS) כדי לשטוף תאים לא מופנמים. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
4. הוסף 300 μL של 0.1% Triton X-100 לבארות ודגור בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
5. שואפים את תכולת הבארות ומחלקים אותם לצינורות פלסטיק סטריליים של 1.5 מ"ל.
6. הכינו דילול של 1 ל-10 של התאים עם מים מזוקקים.
   הערה: התאימו את הדילול כך שניתן יהיה לשחזר בין 30 ל -300 מושבות על לוחות אגר.
7. פיפטה 50 μL של דילול על צלחת אגר שמרים לתת (YM).
8. השתמשו בשיטת צלחת פרושה כדי ליצור מדשאה של תאים על פני צלחת האגר.
9. דוגרים על הלוחות בטמפרטורה של 30°C למשך 48 שעות.
10. ספרו את היחידות יוצרות המושבה (CFUs) שפותחו על לוחות האגר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אגר	מרק		משמש להכנת צלחות YM
תמצית שמרים	מרק		משמש להכנת צלחות YM
תמצית לתת	מרק		משמש להכנת צלחות YM
פפטון	מרק		משמש להכנת צלחות YM
גלוקוז	מרק		משמש להכנת צלחות YM
כתם כחול טריפאן	סיגמא-אולדריץ'		כדי למנות תאים חיים ומתים
תקן מקפרלנד	פישר סיינטיפיק		כדי לתקנן תאים
פרימקווין	מרק		משמש כפוטונסיטיס
תמיסת חיץ פוספט (PBS)	סיגמא-אולדריץ'		לשטוף ולדלל תאים
סל"ד- 1640 בינוני	ביוכרום		מצע טיפוח למקרופאגים
סרום בקר עוברי (FBS)	ביוכרום		משמש להשלמת מדיום RPMI-1640
פניצילין/סטרפטומיצין/L-גלוטמין	סיגמא-אולדריץ'		נוסף למדיום RPMI-1640
0.1% טריטון X-100	סיגמא-אולדריץ'		משמש לליזה מקרופאגים
צלחת מיקרוטיטר בעלת תחתית שטוחה 96 בארות	גריינר ביו-וואן		משמש ככלי שבתוכו בוצעו תגובות
בקבוק טישו	לאסק		משמש לטיפוח מקרופאגים
צינור צנטריפוגה 50 מ"ל	לאסק		משמש להכיל מקרופאגים
גרוטאות תאים	לאסק		משמש לניתוק מקרופאגים מבקבוק הרקמה
לולאת חיסון	לאסק		משמש כדי לפזר תרבות על צלחת אגר
המוציטומטר	מריאנפילד		כדי לקבוע את ריכוז התא של המקרופאגים
1.5 מ"ל צינורות פלסטיק	מרק		משמש ככלי שבתוכו בוצעו תגובות
UVL	אסקו		משמש להפעלת photoensitiser
אינקובטור CO2	תרמופישר		משמש לדגירת המקרופאגים
ארון בטיחות ביולוגי סוג II	אסקו		כדי לעבוד בבטחה עם הפתוגנים מבלי לגרום נזק למשתמש.